神經營養(yǎng)素受體p75NTR在不同胎齡人胎腦海馬中的表達

1、神經營養(yǎng)素受體p75NTR在不同胎齡人胎腦海馬中的表達 作者：王伴青，胡煜輝，廖義林，彭建安，溫永順【關鍵詞】 神經營養(yǎng)素受體；海馬；人胎腦【關鍵詞】 神經營養(yǎng)素受體；海馬；人胎腦 0引言神經營養(yǎng)素是一個高度保守的生長因子家族,包括兩種受體: 低親和力的神經營養(yǎng)素受體p75 (p75 neurotrophin receptor, p75NTR)和高親和力的Trk. p75NTR是一種Mr為75 000的I型膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族（TNFR）的成員. 在不同的條件下p75NTR發(fā)揮完全不同的生物學效應，一方面它與Trk共表達時，二者結合成雜合二聚體，形成神經營養(yǎng)因子的高親和性受體，促

2、進神經細胞的存活與生長；另一方面，當p75NTR單獨表達時，它能以相同的親和力與所有的神經營養(yǎng)因子結合而誘導細胞凋亡1-2. 海馬屬邊緣系統(tǒng)，與學習記憶、情緒、行為及內臟活動密切相關，在胚胎海馬的發(fā)育過程中，神經細胞的增殖、分化和凋亡活動非常活躍. 我們通過研究p75NTR在胚胎海馬發(fā)育過程中的表達及其變化規(guī)律,探討了p75NTR對神經元發(fā)育的影響.1 / 13 1材料和方法 1.1材料收集臨床水囊引產胎兒45例(性別不限), 按末次月經時間結合測量頂臀長（Patten法3）推算胎齡，按胎齡分成1316 wk（n=10）、1720 wk（n=12）、2124 wk（n=9）、2528 wk（n

3、=8）、2932 wk（n=6） 5組. 每例水囊引產胎兒均無神經系統(tǒng)畸形，其母親均查體健康，由井岡山學院附屬醫(yī)院和吉安市第一人民醫(yī)院婦產科經胎兒母親及家屬簽字同意后提供. 鼠抗人p75NTR mAb為美國Santa Cruz公司產品，免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于北京中山生物試劑公司. 1.2方法 1.2.1取材、固定及切片水囊引產胎兒娩出后( 均已死亡) 23 h內開胸經左心室先以生理鹽水灌注沖洗干凈后,再以40 g/L多聚甲醛液/0.1 mol磷酸緩沖液灌注固定4 h, 打開頭皮及顱骨,撕除腦表面之被膜, 切取海馬組織,相同固定液后固定1 wk，經7001000 mL/L上行梯度

4、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋, 連續(xù)切片，切片厚度為8 ,貼于涂有多聚賴氨酸膠的清潔玻璃片上烤干待用. 1.2.2免疫組化染色(法)采用mAb鏈菌素親生物蛋白過氧化物酶()免疫組化法. 石蠟切片經常規(guī)脫蠟后, 清水沖洗，滴加30 g/L過氧化酶阻斷劑50 L,室溫30 min,清水沖洗; 0.01 mol/L S洗5 min×3次;加10 g/L正常山羊血清50 L,室溫下孵育30 min,吸去多余液體;5組分別滴加鼠抗人p75 mAb（1100）（Santa Cruz,USA） 50 L,4的冰箱過夜, 0.01 mol/L S洗5 min×3次；加生物素標記二抗（12

5、00） 50 L,室溫下1 h， 0.01 mol/LS洗5 min×3次；加溶液50 L,室溫下1 h，0.01 mol/L S洗5 min×3次;加DAB液100 L,顯色5 min后雙蒸水沖洗中止反應,脫水、透明、中性樹脂封片,光鏡下觀察. 用0.01 mol/L S代替一抗作對照實驗，結果為陰性. 1.2.3圖像分析每組每例取3張切片，每張切片在光鏡(×400)下陽性細胞分布均勻的部位隨機各取510個視野,圖像經攝像儀輸入電子計算機,經HMIAS2000高清晰度彩色醫(yī)學圖文分析系統(tǒng)細胞測量程序處理,計算出每組陽性細胞數(shù)和總細胞數(shù)，再計算出每組樣本的陽性細胞

6、百分率. 統(tǒng)計學處理: 采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件中R×C表資料的2檢驗比較組間p75NTR陽性細胞百分率，P<0.05認為有統(tǒng)計學意義. 2結果 2.1p75NTR的表達與分布在光學顯微鏡下觀察p75NTR免疫反應陽性產物為棕黃色顆粒，主要定位于細胞質內，部分胞核淡染. 在不同胎齡的切片均可見p75NTR免疫反應陽性細胞. 由于在16 wk前胎兒海馬內的神經細胞體積小而圓，細胞核大，胞質少，p75NTR免疫反應產物范圍小，部分結構陽性細胞計數(shù)較困難. 在胚胎1316 wk，海馬CA1,CA2,CA3區(qū)錐體細胞層內均可見分布著大量小而密集的強染或中等度染色的圓形p7

7、5NTR陽性細胞（圖1A），隨著胎齡的增加，細胞形態(tài)由小而圓逐漸變?yōu)殄F體形. 在緊靠錐體細胞層淺表面的輻射層內也可見排列許多胞體較大、形態(tài)與錐體細胞類似、排列松散的p75NTR陽性細胞，并且呈現(xiàn)明顯的神經氈染色（圖1B）. 17 wk之后的海馬齒狀回已清晰可辨，可見大量密集排列的陽性顆粒細胞，CA1,CA2及CA3區(qū)的陽性錐體細胞密度隨胎齡增長而逐漸降低，細胞體積進一步增大，輻射層神經氈染色強度減弱（圖1C）. 32 wk時，p75NTR陽性細胞數(shù)目明顯減少，主要分布于齒狀回，在海馬CA1區(qū)錐體細胞層深部及CA1/CA2交界處可見少量散在分布且染色較弱的大型錐體細胞，其余部位未見或僅見一些微弱

8、染色、輪廓模糊的陽性細胞，輻射層神經氈染色消失(圖1D). 2.2各組p75陽性細胞率比較不同組別胎齡為1316, 1720, 2124, 2528, 2932 wk的人胚胎海馬p75NTR陽性細胞百分率(%)分別為43.2, 36.8, 25.7, 19.5, 14.3, 陽性細胞百分率隨胎齡的增加而呈現(xiàn)降低趨勢， 具有顯著性的統(tǒng)計學差異（P<0.01）. 3討論許多在體和體外實驗已經證實4-6p75NTR的高表達會導致神經元的死亡（尤其是在中樞神經系統(tǒng)發(fā)育階段），但也有研究表明p75NTR的缺失也會引起感覺神經元數(shù)目的大量減少7-8. 還有實驗證實p75NTR有助于小腦神經細

9、胞和感覺神經Schwann細胞的遷移9-11. p75NTR對細胞的存活與死亡的作用及其機制目前仍不明確. A: 14 wk胎兒海馬CA1區(qū); B: 16 wk胎兒海馬CA1區(qū)輻射層; C: 19 wk胎兒海馬CA2區(qū); D: 32 wk胎兒海馬齒狀回. 圖1p75NTR的分布SP ×400 海馬是神經干細胞的發(fā)源地之一，在胚胎發(fā)育過程中海馬神經細胞的增殖分化和凋亡活動非?；钴S12-13. 本實驗在各個發(fā)育階段的海馬切片中均檢測到p75NTR的免疫反應陽性表達細胞，而且在分布部位和形態(tài)上存在差異；本研究表明，隨著胎齡的增加p75NTR陽性細胞表現(xiàn)出密度降低、數(shù)目減少的趨勢，與海馬神經

10、細胞的總體發(fā)育進程相吻合. 在1316 wk的人胚胎海馬中的p75NTR高表達, 而在胎齡32 wk時海馬CA1, CA2和CA3等部位未見或僅見一些弱染色、輪廓模糊的大型p75NTR陽性錐體形細胞. 這種結果表明p75NTR主要在未分化和未成熟的神經細胞中高表達，隨著海馬的發(fā)育這些細胞通過遷移和分化而分布于海馬各部；而在此過程中，留在發(fā)育較早的部位的神經細胞的逐漸發(fā)育成熟或凋亡，p75NTR陽性細胞的密度和數(shù)目表現(xiàn)為顯著的下調. 在胎齡32 wk時齒狀回仍存在一定數(shù)量的p75NTR陽性細胞，說明在神經系統(tǒng)發(fā)育的后期甚至在神經系統(tǒng)發(fā)育成熟后齒狀回可能仍然存在神經干細胞. 本研究表明p75NTR

11、主要在神經細胞的早期發(fā)育過程中豐富表達，通過一些信號通路調控神經細胞的凋亡與分化.在神經細胞的誘導、增殖、遷移、分化、突觸的建立和神經的形成、凋亡等一系列過程中發(fā)揮了關鍵性的生物學效應. 但其作用機制仍有待于進一步研究. 【參考文獻】 1 Wang X,Bauer JB,Li Y,et al. Characterization of a p75NTR apoptotic signal-ing pathway using a novel cellular model J.J Biol Chem,2001,276(36):33812. 2 Yamashita T,Fujitani M,Hata K

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