實(shí)驗(yàn)聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、實(shí)驗(yàn) 7 聚丙烯酰胺凝膠電泳 原理 一 聚丙烯酰胺凝膠電泳( polyacrylamide gel electrophoresis, 簡(jiǎn)稱(chēng) PAGE )，由稱(chēng)盤(pán)狀電泳。 這種電泳是在區(qū)帶電泳的基礎(chǔ)上， 以孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠作為支持物， 采用電泳 基質(zhì)的不連續(xù)體系(即凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子成分的不連續(xù)性、 pH 的不連續(xù)性及 電位梯度的不連續(xù)性) ，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶(厚度為 10-2cm),然后再進(jìn)行電泳分離。 圓盤(pán)電泳名稱(chēng)來(lái)源即由于此法的原理是依靠基質(zhì)的不連續(xù)性( discontinuity )，湊巧在垂 直柱形凝膠上分散出的區(qū)帶也很象圓盤(pán)狀( d

2、iscoid shape),取不連續(xù)性”和圓盤(pán)狀”的 英文字頭disc”。因此英文名稱(chēng)為disc electrophoresis”，中文直譯為盤(pán)狀電泳。 儀器裝置：如 圖 A 所示，上下兩個(gè)槽為圓形或方形，其中注入緩沖液(圖中曲線(xiàn)表示 緩沖液面)。上下槽的緩沖液分別有正負(fù)電極通入。 下槽外殼在必要時(shí)可通入冷水促使降溫, 水流方向用箭頭表示。上槽底部有許多小孔,可插入裝有聚丙烯酰胺的玻璃管。 在圓盤(pán)電泳過(guò)程中有三種物理效應(yīng)： 樣品的濃縮效應(yīng), 凝膠的分子篩效應(yīng), 一般 電泳分離的電荷效應(yīng)。由于這三種物理效應(yīng), 使樣品分離效果好, 分辨率高。下面就圓盤(pán)電 泳過(guò)程中的三種物理效應(yīng)的原理加以說(shuō)明： 1

3、. 樣品的濃縮效應(yīng)：由于電泳基質(zhì)的 4 個(gè)不連續(xù)性,使樣品在電泳開(kāi)始時(shí),得以濃縮, 然后再被分離。 ( 1 )凝膠層的不連續(xù)性：濃縮膠：為大孔凝膠,有防止對(duì)流的作用。 分離膠：為小孔凝膠,也有防止對(duì)流的作用。樣品在其中進(jìn)行電泳和分子篩分離。 蛋白質(zhì)在大孔凝膠中受到的阻力小,移動(dòng)速度快。進(jìn)入小孔凝膠時(shí)遇到的阻力大, 速度就減慢了。由于凝膠的不連續(xù)性,在大孔膠與小孔膠的界面處就會(huì)使樣品濃縮, 區(qū)帶變窄。( 2)緩沖離子成分的不連續(xù)性。 (3)電位梯度的不連續(xù)性。 (4)pH 的不連續(xù) 性：在濃縮膠和分離膠之間有 pH 的不連續(xù)性,濃縮膠應(yīng)有的 pH 應(yīng)為 8.3,分離膠應(yīng) 有的 pH 為 8.9。

4、 2. 分子篩效應(yīng)： 分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過(guò)一定孔徑的分離膠時(shí), 受阻 滯的程度不同,因此表現(xiàn)出不同的遷移率,即所謂的分子篩效應(yīng)。即使凈電荷相似, 也就是說(shuō)自由遷移率相等的蛋白質(zhì),也會(huì)由于分子篩效應(yīng)在分離膠中被分開(kāi)。 此處分子篩效應(yīng)是指樣品通過(guò)一定孔徑的凝膠時(shí), 小分子走在前面, 大分子走在 后面。而在柱層析方法中的分子篩效應(yīng),則是大分子通過(guò)凝膠顆粒之間的縫隙先流出 來(lái),而小分子則通過(guò)凝膠顆粒內(nèi)的孔道后流出。 3. 電荷效應(yīng)：蛋白質(zhì)混合物在凝膠界面處被高度濃縮，堆積成層，形成一狹小的高濃度 的蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所載有的電荷不同，因而遷移率不同。承載有效 電荷多的，泳

5、動(dòng)的快，反之則慢。因此各種蛋白質(zhì)就以一定的順序排列成一個(gè)個(gè)的圓 盤(pán)狀。在進(jìn)入分離膠時(shí)，此種電荷效應(yīng)仍起作用。 聚丙烯酰胺凝膠的性能及制備原理 1. 性 能： 聚丙烯酰胺的機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，相對(duì)地比較穩(wěn)定，對(duì) pH 和溫度變 化較穩(wěn)定，在很多溶劑中不溶，是非離子型的，沒(méi)有吸附和電滲作用。原料成分要采 用高純度制品，通過(guò)改變濃度和交聯(lián)度，可以控制孔徑變動(dòng)在極廣泛的范圍，并且制 備凝膠的重復(fù)性好，由于純度高及不溶性，因此還適合于少量樣品的制備，不致污染 樣品。 2. 制 備原理：聚丙烯酰胺凝膠是用丙烯酰胺（ acrylamide 簡(jiǎn)稱(chēng) Acr ）和交聯(lián)劑亞甲基雙 丙烯酰胺 （ N,N,N,

6、N-methylene bisacrylamide 簡(jiǎn)稱(chēng) Bis ）在催化劑的作用下聚合而成。 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： （ 1）化學(xué)聚合：化學(xué)聚合的催化劑多采用過(guò)硫酸銨（ ammonium persulfate 簡(jiǎn)稱(chēng) AP ） 或過(guò)硫酸鉀，此外還需要一種脂肪族叔胺作為加速劑，最有效的加速劑為 N,N,N,N- -四甲基乙二胺（N,N,N, Ntetramethyl ethylenediamine,簡(jiǎn)稱(chēng) TEMED ）,其次為三乙醇 胺及二甲氨基丙腈（ 3-dimethylaminopropionitrile, 簡(jiǎn)稱(chēng) DMPN ）。在叔胺的作用下，由 過(guò)硫酸銨形成的氧的自由基，后者

7、又使單體形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。叔胺要 處于自由堿基狀態(tài)下才有效，所以在低 pH 時(shí)常會(huì)延遲聚合作用。分子氧阻止鏈的延 長(zhǎng)，妨礙聚合作用，一些金屬也能抑制聚合作用。冷卻可以使聚合速度變慢。通?？?制這些因素使聚合在 1 小時(shí)內(nèi)完成，以便使凝膠的性質(zhì)穩(wěn)定。 當(dāng)聚合反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，過(guò)硫酸銨溶于水產(chǎn)生自由基 QO82-T 2SO42-，這些自由基活 化 TEMED 使之形成帶不成對(duì)電子的活化分子。 活化的 TEMED 與丙烯酰胺分子或甲 叉雙丙烯酰胺分子結(jié)合時(shí)能轉(zhuǎn)移自由基使之活化。 活化的丙烯酰胺可再以同樣方式轉(zhuǎn) 移自由基活化另一分子的丙烯酰胺，并與之結(jié)合，這樣不斷活化下去，直至使所有的 丙烯酰胺

8、活化結(jié)合成長(zhǎng)鏈，其末端的丙烯酰胺分子始終具有轉(zhuǎn)移自由基的活性。 但僅 丙烯酰胺的多聚體只能形成長(zhǎng)鏈，盡管粘稠，但不能形成凝膠。 （ 2）光聚合：光聚合 通常用核黃素為催化劑。不一定加 TEMED 即能聚合，但加入則可加速聚合。 甲叉雙丙烯酰胺是由兩個(gè)丙烯酰胺分子靠甲叉基相互連接構(gòu)成的， 其中的兩個(gè)丙 烯酰胺都可以分別被活化的 TEMED 所活化， 而后再不斷活化丙烯酰胺分子結(jié)合成長(zhǎng) 鏈；或者分別被已形成長(zhǎng)鏈的丙烯酰胺鏈活化連接；或者一邊被 TEMED 活化后與丙 烯酰胺形成長(zhǎng)鏈，另一邊與已合成的丙烯酰胺長(zhǎng)鏈結(jié)合等，其反應(yīng)是隨機(jī)的，多種多 樣的，但無(wú)論如何反應(yīng)， 在形成的丙烯酰胺鏈之間由于甲叉雙

9、丙烯酰胺的橫鏈而被連 接起來(lái)，最終形成立體的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)甲叉雙丙烯酰胺是一種引入橫鏈的交聯(lián)劑。 這樣按一定比例的 Acr 和 Bis 在 AP 和 TEMED 的催化下形成一種具有多孔、多分枝 而又相互連接的聚丙烯酰胺凝膠。 （ 2）光聚合：光聚合通常用核黃素為催化劑。不一定加 TEMED 即能聚合，但加入 則可加速聚合，用核黃素進(jìn)行光聚合的優(yōu)點(diǎn)是：核黃素的用量很低 （1mg/ml）;通 過(guò)光照可以預(yù)定聚合時(shí)間，但光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸變小， 不太穩(wěn)定，所以用它制備大孔凝膠較適合?；瘜W(xué)聚合的凝膠孔徑較小，因而采用過(guò) 硫酸銨 -TEMED 催化系統(tǒng)制備小孔凝膠（分離膠） ，

10、而且各次制備的重復(fù)性較好。 3 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑的大小關(guān)系：凝膠濃度與被分離物的分子量大小關(guān)系，大 致如下表所示： Mr 范圍與凝膠濃度的關(guān)系 Mr范圍 適用的凝膠濃度 蛋 v 104 2030% 4 14X 10 1520% 白 4X 10 1 X 10 1015% 質(zhì) 15X 105 510% 5X 105 25% 核 v 104 1520% 酸 104105 510% (RNA) 5 6 10 2X 10 22.6% 聚丙烯酰胺凝膠的網(wǎng)孔大小、機(jī)械強(qiáng)度、彈性均由膠的總濃度與 Bis 的濃度比及聚合的 條件來(lái)決定?？讖脚c總濃度有關(guān)，總濃度越大，孔徑則相應(yīng)變小，機(jī)械強(qiáng)度增強(qiáng)；總濃度越

11、小，則相反。當(dāng)總濃度不變時(shí)，甲叉雙丙烯酰胺( Bis)的濃度在 5%時(shí)孔徑最小，高于或低 于此值時(shí)，聚合孔徑相對(duì)變大。因此，配膠時(shí)可以通過(guò)改變丙烯酰胺的總量和甲叉雙丙烯酰 胺的含量，作為控制凝膠孔徑大小的方法。 聚丙烯酰胺凝膠形成的網(wǎng)孔在電泳過(guò)程中具有分子篩的作用。 因此在制備凝膠時(shí)，應(yīng)該 根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小來(lái)選擇凝膠的濃度。 常用的所謂標(biāo)準(zhǔn)凝膠是指濃度為 7.5%的凝膠，大多數(shù)生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)在此凝膠中電 泳能得到滿(mǎn)意的結(jié)果。當(dāng)分析一個(gè)未知樣品時(shí)，常常先用 7.5%的標(biāo)準(zhǔn)凝膠或用 4%10%的 凝膠梯度來(lái)試測(cè)，而后選出適宜的凝膠濃度。 用于研究大分子核酸的凝膠多為大孔徑凝膠，太軟，不易

12、操作，最好加入 0.5%瓊脂糖。 有的在 3%凝膠中加入 20%的蔗糖，也可增加機(jī)械強(qiáng)度而不影響孔徑大小。 三 常見(jiàn)的幾種蛋白質(zhì)染色染料 1. 氨基黑 10B(amino black 10B) : C22Hi3Oi2N6S3Na3 Mr=715，入 max=620nm630nm.氨基黑 是酸性染料是最常用的蛋白質(zhì)染料。但用氨基黑 10B 染 SDS-蛋白質(zhì)時(shí)效果不好。氨 基黑染不同蛋白質(zhì)時(shí)的著色度不同、色調(diào)不一(有藍(lán)、黑、棕等) 。 2. 考馬斯亮藍(lán)R 250(Comassie brilliant blue R250):染色靈敏度比氨基 黑高 5 倍。尤 其適用于 SDS 微量蛋白質(zhì)染色。 考

13、馬斯亮藍(lán) G250，又名 Xylene brilliant cyaninG。染色靈敏度不如 R250，但比氨基 黑高 3 倍。優(yōu)點(diǎn)在于它在三氯乙酸中不溶而成膠體，能選擇地染色蛋白質(zhì)而幾乎無(wú) 本底色，所以常用于需要重復(fù)性好和穩(wěn)定的染色，適于做定量分析。 聚丙烯酰胺凝膠電泳具有使樣品區(qū)帶濃縮變窄的作用，所以分辨率高， 在很多情 況下超過(guò)高速離心和常用的層析及一般電泳技術(shù)：設(shè)備簡(jiǎn)單，樣品量小( 1100 卩 g); 時(shí)間短， 操作簡(jiǎn)便， 可分離物質(zhì)的分子大小范圍廣泛， 由多肽到核糖核蛋白體及病毒 都可以分離，亦可改變?yōu)槌⒘繙y(cè)定( 10-1210-9g),并可結(jié)合 SDS 來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)亞 基分子量；

14、或測(cè)定核酸等的分子量。這種方法現(xiàn)在幾乎取代了超速離心沉降法。它還 可以結(jié)合等電聚焦電泳以提高分辨率。 聚丙烯酰胺凝膠電泳用途較廣，對(duì)生物高分子化合物能進(jìn)行分離定性定量分析， 又能用于制備 mg 水平的材料。 操作方法 垂直板凝膠電泳 目前常用的聚丙烯酰胺凝膠電泳是垂直板型電泳， 垂直板電泳是在兩塊垂直放置 的、間隔幾個(gè) mm 的平行玻璃板中進(jìn)行制膠的，所得的是垂直的平板狀凝膠。具有以 下特點(diǎn)： 1. 表面積大，易于冷卻控制溫度。 2. 電泳后易于取出凝膠。 3. 能在同一凝膠板上，同一操作條件下，同時(shí)比較多個(gè)樣品。 4. 可做雙向電泳。 5. 便于利用各種鑒定方法，尤其便于進(jìn)行放射自顯影。 一

15、 垂直型制膠模具 一般的垂直板型制膠模具是由兩塊長(zhǎng)短不等的玻璃塊組成 （或由兩塊等長(zhǎng)的玻璃 片，其中一塊的頂端制成 “U”形）。玻璃板的長(zhǎng)邊緣之間放置兩條用特殊塑料制成的 間隔條（根據(jù)所需膠的厚度，選用間隔條的厚度） ，以配套的制膠底座和夾子固定， 確保無(wú)泄漏的孔隙，即可灌膠。如無(wú)配套的制膠底座，則在兩塊玻璃板之間夾好隔條 后，于板的兩側(cè)及底部用醫(yī)用膠帶或粘膠紙帶封好，將 1%的瓊脂糖溶解，冷至 50 C 左右，沿模具的兩邊條內(nèi)側(cè)用滴管滴入，封住縫隙，以免灌膠時(shí)膠液泄漏。在較長(zhǎng)的 制膠模具中灌注膠液時(shí)，可將模具傾斜，與桌面成 4560 角，將膠液注入兩塊玻璃 板之間的空隙中，不斷輕敲玻璃板，使

16、氣泡上浮排出，一直灌到模具的頂部，此時(shí)可 將模具放置成 10角，以降低泄漏的可能性，立即插入樣品孔模板（或稱(chēng)梳子） ，注 意梳齒的邊緣不能帶入氣泡。室溫時(shí)聚合需要 40 分鐘左右，觀察梳齒附近凝膠中呈 現(xiàn)光線(xiàn)折射的波紋時(shí)， 即表示聚合反應(yīng)已完成。 使用凝膠前，先撕去凝膠底部的膠條， 將凝膠及模具安裝在電極槽中，然后拔出梳子，立即用水沖洗孔格（此步很重要！因 為取出梳子后，梳子上面吸附的和膠頂部少量未聚合完的丙烯酰胺會(huì)流入孔內(nèi)， 在慢 慢聚合，使孔底不平，將影響電泳條帶的形狀不整齊） 。垂直板型電泳裝置和制膠模 具見(jiàn)圖B 二貯液 1貯液配方（Laemmli ）（用量可依需要倍放） 貯液 配方 電

17、極緩沖液（用時(shí) 10 倍稀釋?zhuān)?Tris 7.55g,Gly 36g,用水定容到 250ml 凝膠貯液（N） Acr 8.76g, Bis 0.24g,用水定容到 30ml 分離膠緩沖液（L） Tris27.2g,H2O120ml,用濃 HCI 調(diào)到 pH8.8，用水定容到 150ml 濃縮膠緩沖液（M ） Tris9.08g,H20140ml,用濃 HCI 調(diào)到 Ph6.8，用水定容到 150ml 3.不同濃度（%）分離膠的配制（可按總體積按比例放大） 貯液 凝膠濃度 5% 7.5% 10.0% 12.5% 15.0% L(ml) 6.3 6.3 6.3 6.3. 6.3 N(ml) 4.3

18、 6.2 8.4 10.5 12.6 H2O(ml) 14.6 12.5 10.4 8.3 6.2 TEMED(卩 l) 10 10 10 10 10 Ap(mg) 20 20 20 20 20 4.濃縮膠配方 M N H2O TEMED Ap 1.9ml 1.15ml 4.5ml 5 n l 10mg 三凝膠系統(tǒng)和制膠 垂直板型電泳的凝膠系統(tǒng)有兩類(lèi)。一類(lèi)是不連續(xù)系統(tǒng)，主要用于蛋白質(zhì)的分離； 另一類(lèi)是連續(xù)系統(tǒng)，只有一層凝膠，一種 pH 和一種緩沖系統(tǒng)，將樣品透析或稀釋?zhuān)?使樣品的電導(dǎo)很低， 這樣人工造成電位梯度差異， 也可使樣品濃縮，達(dá)到同樣分辨力。 近年來(lái)在蛋白質(zhì)和核酸的凝膠電泳研究中，廣泛

19、使用著這種連續(xù)系統(tǒng)。 1分離膠的制備：將貯液由冰箱中取出，達(dá)到室溫后，按表中的比例配制工作溶液， 分離膠先不要和過(guò)硫酸銨混合，分別放在真空干燥器中抽出溶解的空氣，取出趕快 混勻，灌入玻璃板之間的空隙，達(dá)到合適的高度后，用細(xì)滴管在已經(jīng)加好的分離膠 面加 35mm 高的水層。加蒸餾水的目的，除隔離空氣中的氧外，并能消除分離膠 表面的曲度，使凝膠表面平坦，否則會(huì)影響帶形和分辨率。因此著一步操作要特別 小心，盡量防止水與膠液的混合。注意不要打攪凝膠液面，切忌加水時(shí)成滴狀墜入 膠液，這樣會(huì)使頂部凝膠濃度變稀，以致改變預(yù)期的凝膠孔徑，或從而造成凝膠表 面的不平坦。即使小心地操作，凝膠頂端約 13mm 有時(shí)

20、也受影響，往往凝聚不良或 孔徑改變，使這一區(qū)域內(nèi)所形成的區(qū)帶的遷移率值不可靠。 水層放好后，靜置膠液進(jìn)行聚合反應(yīng)，聚合時(shí)溫度要與電泳時(shí)的溫度相同，正常 情況下 10 分鐘即開(kāi)始聚合，應(yīng)控制在 3060 分鐘聚合完成。 剛加水時(shí)看出有界面， 隨后逐漸消失， 等到再看到界面時(shí)， 表明凝膠已經(jīng)聚合。 再靜置 30min 使聚合完全。 2. 濃縮膠的制備：當(dāng)分離膠完全聚合后，甩去分離膠表面的水層，用濾紙條（無(wú) 毛邊）吸去殘留的水液，濾紙盡量不要接觸凝膠表面。按比例混勻濃縮膠（最好預(yù)先 抽氣，使用是混合，先用這種凝膠液漂洗一下分離膠頂，除去漂洗液后，將濃縮膠液 加入玻璃板之間剩余的間隙，并立即插入樣品孔

21、模板（或稱(chēng)梳子） ，注意觀察凝膠的 聚合過(guò)程，觀察梳齒附近凝膠中呈現(xiàn)光線(xiàn)折射的波紋時(shí)，即表明聚合反應(yīng)已經(jīng)完成。 3. 上樣 樣品的用量與凝膠板厚度有關(guān)系。對(duì) 2mm 厚、10mm 寬的樣品槽，用約 20 卩 I樣品 液；對(duì)4mm 厚、10mm 寬的樣品槽，用約 40 卩 I樣品液。每卩 I 樣品液約含 0.110 卩 g 樣品。形成的樣品液層約 1mm 高。 在樣品液中常加入上樣緩沖液（ 40%蔗糖 +溴酚藍(lán)）。一般情況下，上樣緩沖液與樣 品的比例為 1：11：2 為最宜。 電泳過(guò)程同垂直管形盤(pán)狀電泳。 4. 電泳 將電泳槽和電泳儀連接 ,上槽為負(fù)極 ,下槽為正極。在電泳過(guò)程中，一般要求電流

22、保持穩(wěn)定，這時(shí)可見(jiàn)電壓升高。電泳時(shí)間與所用緩沖液和樣品有關(guān)，一般可根據(jù)指示 染料的遷移來(lái)決定，如指示劑染料已遷移到距分離膠的下端 1cm 時(shí)，就可停止電泳， 關(guān)閉電源，取出凝膠裝置。 緩沖液可再行使用， 但應(yīng)注 .上下槽緩沖液不能混合或互換， 因下槽混入了催化劑及 氯離子。如將后槽的緩沖液用于前槽，則影響電泳。 5剝膠 電泳結(jié)束后，從電泳裝置上卸下制膠模具，取下制膠板中的短玻璃板及間隔條，用 間隔條慢慢將凝膠剝下。一般剝膠方向是從濃縮膠端開(kāi)始。剝膠時(shí)注意不要損傷凝膠表 面。 6. 固定：為防止凝膠內(nèi)已分離成分的擴(kuò)散， 需要進(jìn)行固定。只要把剝下的凝膠浸泡在 7%乙酸或 12.5%三氯乙酸的水溶液

23、中幾分鐘即可；或浸泡在 7%或 12.5%三氯乙酸配 制的染色液中，同時(shí)進(jìn)行固定和染色。 7. 染色： 1）蛋白質(zhì)的一般染色方法見(jiàn)下表 蛋白質(zhì)的染色方法 方法 固定液 染色液 染色時(shí)間 脫色液 氨基黑 10B 甲醇 7%乙酸 0.1mol/L NaOH 中 1%氨基黑 7%乙酸中 0.51%氨基黑 5mi n (RT) 2h(RT) 5 %乙醇 7%乙酸 考馬斯亮藍(lán) R250 20%磺基水楊酸 10%三氯乙酸 樣品中含尿素的在 5%三氯乙酸中固 疋 0.25%R250 水溶液 10%三氯乙酸-1% R250=19 : 1 (V/V ) 5%磺基水楊酸和 1%R250=19 : 1 5mi n(

24、RT) 30mi n (RT) 1h (RT) 7%乙酸 10%三氯乙 酸 90%甲酸 考馬斯亮藍(lán) G250 6%乙酸 12.5%三氯乙酸 6%乙酸中 1%G250 12.5%三氯乙酸中 0.1%G250 10mi n (RT) 30mi n (RT) 甲醇：水：濃 氨水=64: 36: 1 （2 ）銀染色法：此方法靈敏度高，適合于微量樣品分析。 電泳后立即將凝膠浸泡在固定液（ 5 0 0 m l 乙 醇 、 1 0 0 m l 冰 乙 酸 、 4 0 0m l 蒸 餾 水 ） 中 , 至少 30min，如有必要，凝膠可在固定液中過(guò)夜。 這一步可使蛋白質(zhì)沉淀， 并使 SDS 從凝膠中擴(kuò)散出來(lái)。

25、 將凝膠放在浸泡液中（75ml 乙醇、17.00g 乙酸鈉、戊二醛（25%W/V ）、0.50g 硫代 硫酸鈉（5 出 0）,用蒸餾水溶解后定容到 250ml ）中 30min。 用蒸餾水洗 3 次，每次 5min。 將凝膠在銀溶液（0.25g 硝酸銀、50 卩 l 甲醛、加蒸餾水至 250ml）中放置 20min . 在顯色液（6.25g 碳酸鈉、25 卩 l 甲醛，以蒸餾水溶解后，定容至 250ml）中放置 210min。視蛋白帶顯示深棕色為止。 為終止反應(yīng)，將凝膠放在終止液（ 3.65g EDTA-Na.2H 2O,用蒸餾水定容到 250ml） 中 10min 。 用蒸餾水洗 3 次，每

26、次 510min。 如欲保存，將凝膠在保存液（ 25ml87%甘油，用蒸餾水加至 250ml ）中放置 2030min，然后將凝膠放在玻璃板上，再用保存液浸濕的玻璃紙包住凝膠在室溫 下涼干。注意不要將凝膠加溫，這樣會(huì)使銀染色漂白。 以上銀染色的每一步都應(yīng)在日光下進(jìn)行， 并且均勻地震蕩，銀染色用的試劑純 度以及蒸餾水的純度都極大地影響銀染色的質(zhì)量。如聚合的甲醛或戊二醛不能使用。 要用蒸餾水做進(jìn)一步的無(wú)離子處理，最好使用超純水。 8. 脫色及保存 將染色的凝膠放入脫色液中，輕輕地振搖脫色，經(jīng)常更換新溶液，直到染料不再 洗出，背景幾乎無(wú)色為止。 脫色后的凝膠放在 7%醋酸溶液中，可以長(zhǎng)期保存。 試劑

27、和器材 1丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺：一般用電泳做定性分析工作，用分析純的 Acr 和 Bis，即可 獲得滿(mǎn)意的結(jié)果。無(wú)需對(duì)試劑做進(jìn)一步的純化。 Acr 和 Bis 不純時(shí) （主要雜質(zhì)是丙烯酸） 會(huì)使聚合不均一， 或聚合時(shí)間延長(zhǎng)甚至不聚合。 對(duì)于精細(xì)的分析工作， 尤其是定量分析工作和制備工作， 要求嚴(yán)格的可重復(fù)性或要求在波長(zhǎng) 260280nm 無(wú)吸收，就需要純度更高的 Acr 和 Bis ，可將商品的 Acr 和 Bis 重結(jié)晶。 Acr 重結(jié)晶方法：將 Acr 溶于 50C氯仿中（70g/L）,熱過(guò)濾。冷卻到一 20C結(jié)晶，用 冷的布氏漏斗過(guò)濾收集結(jié)晶。用冷氯仿淋洗，真空干燥。 Acr 的熔點(diǎn)

28、為 84.5 0.3C。 純化的 Acr 水溶液的 pH 是 4.95.2。只要此 pH 值變化不大于 0.4pH 單位，就可使用。 反復(fù)進(jìn)行這一重結(jié)晶過(guò)程，并不能絕對(duì)純化 Acr。因?yàn)?Acr 的水溶液（尤其是堿性時(shí)）總不 斷水解放出丙烯酸和 NH 3、NH 4+，使 pH 略有下降。用離子交換技術(shù)可除去丙烯酸，但過(guò)程 復(fù)雜，無(wú)此必要。 Bis 的重結(jié)晶：將 12gBis 溶于 4050C的 1000ml 丙酮中，熱過(guò)濾。慢慢冷卻到 20C, 過(guò)濾或離心收集結(jié)晶。用冷丙酮洗滌后，真空干燥。 Bis 的熔點(diǎn)為 185C。 試劑的貯存：固體 Acr 和 Bis 需貯存于棕色瓶中，保持干燥和較低溫

29、度（ 4C最好）是相當(dāng) 穩(wěn)定的。如保存不當(dāng)，在超聲波、 丫 -輻射或天然光作用下， Acr 自身能聚合成鏈、（烯基間 反應(yīng)）。酰胺基也會(huì)進(jìn)行縮合，形成亞胺橋而交聯(lián)，試劑失效。 Acr 和 Bis 的貯液，會(huì)由于水解作用而形成丙烯酸和 NH3。溶液裝在棕色瓶中，貯于 冰箱（4C）,能部分地防止水解。但也只能貯存 12 個(gè)月?？蓽y(cè) pH 值（4.95.2）來(lái)檢查是 否失效。失效溶液不能聚合。 Acr 和 Bis 是神經(jīng)性毒劑，同時(shí)對(duì)皮膚有刺激作用。操作時(shí)要十分小心，避免與皮膚 接觸。大量操作時(shí)（如純化）可在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。 Acr 的半數(shù)致死量（對(duì)小鼠） LD50=170mg/kg。 2. N, N

30、, Nx, N / -四甲基乙二胺（TEMED：應(yīng)密封避光保存。 3. 過(guò)硫酸銨溶液：最好當(dāng)天配制。在冰箱中貯存也不能超過(guò)一星期。 器材： 1. 電泳儀直流穩(wěn)壓電源 2. 垂直板型電泳槽及配套的制膠模具。 附： 一 蛋白質(zhì)超薄凝膠電泳 電泳技術(shù)是利用帶電粒子在電場(chǎng)作用下以不同的速度向電荷相反方向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象來(lái)對(duì) 某些化學(xué)或生物化學(xué)組分進(jìn)行分離分析的， 它已經(jīng)成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中對(duì)蛋白 質(zhì)和核酸分子進(jìn)行檢測(cè)的最常規(guī)工具。 目前蛋白質(zhì)電泳通常采用垂直平板， 分離介質(zhì)為聚丙 烯酰胺凝膠，凝膠厚度一般在 0.751.5mm。但由于電泳過(guò)程中產(chǎn)生的焦耳熱，將在凝膠中 央產(chǎn)生一個(gè)徑向的溫度梯度，

31、從而導(dǎo)致帶電粒子產(chǎn)生徑向的移動(dòng)梯度， 結(jié)果使區(qū)帶展寬， 減 低分辨率。 凝膠越厚，徑向溫度梯度越大，電泳條帶越寬，所以凝膠厚度是影響電泳分辨率 的一個(gè)主要因素。降低厚度到 0.5mm 以下，在染色和照相過(guò)程中容易使膠破碎，而且容易 粘板。 如果直接對(duì)電泳方板進(jìn)行化學(xué)處理，為其涂漬一層親水性的薄膜，在凝膠過(guò)程中，該 膜上所帶的雙鍵也參加聚合， 因此能夠牢固地結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠， 從而克服了凝膠粘板的 情況。 方板的親水性處理 將方板在 10%的 NaOH 中浸泡 1h,洗潔精徹底清洗，流水沖凈，去離子水中洗 3 次， 涼干；乙醇擦拭，涼干；用擦鏡紙沾取改性液（ 1ml95%乙醇加入 10 卩 I

32、MAPS 和 10 卩 I冰醋 酸），均勻涂布玻璃板表面，靜置 10min，再用擦鏡紙沾取 95%乙醇單向擦拭玻璃板，然后 在沿垂直方向擦拭，重復(fù) 3 次此擦拭過(guò)程，涼干。 凹板的硅烷化處理 將凹板用清水、洗潔精和去離子水徹底清洗，烘干；乙醇擦拭，涼干。以濾紙沾取硅烷 化溶液（ 7%二氯二甲基硅烷的氯仿溶液）均勻涂布玻璃板表面，烘干，水清洗，烘干；乙 醇擦拭，涼干。 制膠和電泳 將處理好的玻璃板夾上 0.4mm 厚的夾條，裝在制膠架上，按常規(guī) PAGE 制膠的方法灌 制凝膠。 注意事項(xiàng) 1. 玻 璃板的清潔程度至關(guān)重要，一定要徹底清洗，一種最重要的判斷方法是，當(dāng)用乙醇 擦拭玻璃板時(shí)如果出現(xiàn)彩暈，則表明玻璃板已經(jīng)洗凈。 2. 如 果在灌膠時(shí)發(fā)生漏夜， 需要重新處理兩塊玻璃板， 這是因?yàn)?MAPS 能夠通過(guò)水溶液 污染凹板，在起膠時(shí)容易撕裂凝膠。 3最好每次實(shí)驗(yàn)都用 NaOH 處理方板，因?yàn)椴ＡО灞砻婀枇u基多以一 Si O Si 狀態(tài) 存在，對(duì)硅烷化呈惰性反應(yīng)， NaOH 能使表面硅羥基更多地以 SiOH 形式存在。 4. M APS 也可以用丫 -氨基丙基三乙氧基硅烷（ KH-550 化學(xué)純）代替。 二 利于蛋白質(zhì)回收的染色脫色方法 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE ）和由等電聚焦（IEF ）、SDS-PAGE 組成的雙向 電泳不僅是分析、 分離蛋白質(zhì)的常用方