MSC體內(nèi)外促組織修復(fù)試驗(yàn)方法

1、MSC勺組織修復(fù)作用在機(jī)體組織損傷修復(fù)過程中,MSC是一種重要的參與組織再生的細(xì)胞.在組織損傷引起的特殊信號(hào)作用下, MSC遷徙至損傷部位,在局部增殖,并依據(jù)不同的損傷信息而沿著 不同的途徑分化.MSC易于別離培養(yǎng),體外增殖水平旺盛,因此,MSC是一種實(shí)用的組織修復(fù)種子細(xì)胞. 目前關(guān)于MSC的組織再生功能有兩種理論： 其一,將體外擴(kuò)增的M5c移植到組織損傷部位, 在局部微環(huán)境作用下,定向分化為某一特定類型功能細(xì)胞,直接參與組織損傷修復(fù)過程；其二,移植于損傷部位的細(xì)胞,分泌多種生物活性物質(zhì),包括細(xì)胞趨化、生長、營養(yǎng)因子等, 以改善組織損傷部位再生微循環(huán),促進(jìn)宿主組織中殘存的干/祖細(xì)胞增殖分化,M

2、SC間接參與了組織修復(fù)過程.MSC改善組織再生微環(huán)境,表現(xiàn)為細(xì)胞所分泌的生物活性物質(zhì)具備的多種功能,包括：1趨化周闊的宿主干/祖細(xì)胞遷徙至損傷那位；2促進(jìn)干/祖細(xì)胞的增殖分化；3抑 制受損傷功能細(xì)胞的凋亡；4促進(jìn)毛細(xì)血管新生；5激活周圍細(xì)胞金屬硫蛋白酶活性, 抑制瘢痕形成；6調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能,抑制炎性反響.目前,關(guān)于MSCfi織再生功能的檢測(cè)還沒有一個(gè)明確的標(biāo)準(zhǔn).在體外檢測(cè)中,只能通過檢測(cè)MSO化為受損組織細(xì)胞的水平和MSO泌修復(fù)組織損傷有關(guān)細(xì)胞因子、抗炎因子、營養(yǎng)因子等來鑒定MSC勺組織再生功能,這是判定MSCfi織再生功能的根底,但是這樣的評(píng)判 也存在很大缺陷的, MSC體外的培養(yǎng)環(huán)境和在

3、體內(nèi)微環(huán)境中存在很大差異,微環(huán)境下細(xì)胞 之間的接觸作用,損傷細(xì)胞釋放的因子對(duì) MSC勺刺激作用和趨化彳用等可能都對(duì)MSO泌的細(xì)胞因子種類和劑量有影響.因此,通過在各種適應(yīng)癥模型治療時(shí),對(duì)MSCE微環(huán)境中的組織再生功能的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)是必要的.體外試驗(yàn)：一、檢測(cè)MSO化為受損組織細(xì)胞的水平：體外誘導(dǎo)MSO化為骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、胰島3細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、心肌 細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脊髓基質(zhì)細(xì)胞等.二、檢測(cè)MSO泌修復(fù)組織損傷相關(guān)因子：1、促血管生成因子檢測(cè)： PCR ELISA檢測(cè)UC-MSCi體外是否分泌 HGF VEGF bFGR TGF- 3 1的因子.2、抗炎性因子

4、檢測(cè)： PCR ELISA檢測(cè)UC-MSCi體外是否分泌IL-10 、bFGF TGF-、 IDO.3、促細(xì)胞分裂增殖的因子檢測(cè)：PC址ELISA檢測(cè)UC-MS窿體外是否分泌 HGF、bFGF、IGF-1、GM-CSF EGF PDGF4、抗細(xì)胞凋亡作用：PCR ELISA檢測(cè)MSB否分泌IGF-1、SDF-1 a、VEGF5、趨化作用：PCR ELISA 檢測(cè) MSC否分泌 SDF-1 CXCR4、IL-6、IL-8、CXC MCP-1.體內(nèi)試驗(yàn)：MSC臺(tái)療肝硬化模型、MSC臺(tái)療腎損彳模型、MSC啰復(fù)壞死胰腺組織、MSC用于心血管疾病的 治療、MSCffi于肺纖維化模型等MSC治療肝硬化模型

5、在CCl4誘導(dǎo)的肝硬化模型中,MSC通過抑制肝臟膠原合成、 誘導(dǎo)肝臟內(nèi)源干細(xì)胞的分化增殖、抑制CCl4引起的肝損傷和炎癥、促進(jìn)肝臟血管再生等作用來改善肝臟病變狀況.檢測(cè)指標(biāo)包括：1、MSC抑制膠原合成作用：肝病變部位 膠原的含量2、促細(xì)胞生長作用：HGFT、bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子T、 PDGF 血小板衍生因子3、纖維化逆轉(zhuǎn)作用：組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1 J、TGF3 J的表達(dá)4、炎性和抗炎性因子檢測(cè)：IL6J、TNEoU、INF-yJ、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、 IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制T細(xì)胞、NK

6、細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖和抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生 H2O2.5、促血管生成作用：HGF肝細(xì)胞生長因子T、VEGF血管內(nèi)皮生長因子T、 TGF-1 轉(zhuǎn)化生長因子T、 bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子T、 PDGF 血小板衍生 因子T、內(nèi)皮素endothelin T、表皮調(diào)節(jié)蛋白 epiregulin T等.6、檢測(cè)輸注陽性標(biāo)記 MS%受損組織中是否存在.7、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對(duì)照組相比是否有恢復(fù)的趨勢(shì).8、觀察統(tǒng)計(jì)治療組與對(duì)照組動(dòng)物的精神狀態(tài)或存活狀態(tài).9、組織切片觀察治療組受損組織結(jié)構(gòu)、功能細(xì)胞分布是否趨于正常.10、檢測(cè)受損組織的功能是否有所改善.11、病理切片觀察受損組織周圍炎性細(xì)胞情況,檢測(cè)炎

7、性因子分泌情況.12、受損組織中趨化因子 SDF-1T、IL-8T、CXC T、MCP-1 T 單核趨化蛋白 等的含量.MSC治療腎損傷模型在急性腎損傷、慢性腎損傷等動(dòng)物模型中,MSC通過誘導(dǎo)腎臟內(nèi)源干細(xì)胞的分化增殖、腎小管上皮細(xì)胞增殖、抑制腎臟損傷和炎癥、促進(jìn)腎臟血管再生等作用改善腎臟功能.檢測(cè)指標(biāo)包括：1、促細(xì)胞生長作用：HGFT、bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子T、PDGF 血小板衍生因子T2、炎性和抗炎性因子檢測(cè)：IL-6,、TNF- a,、INF- 丫,、IL-1 、一氧化氮合酶 ,、IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制 T細(xì)胞

8、、NK 細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖和抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生H2O2.3、促血管生成作用：HGF肝細(xì)胞生長因子T、VEGR血管內(nèi)皮生長因子T、TGF-1 轉(zhuǎn)化生長因子T、bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子"PDGF 血小板衍生因子T、內(nèi)皮素endothelin T、表皮調(diào)節(jié)蛋白epiregulin T等.4、檢測(cè)輸注陽性標(biāo)記 MSCB受損組織中是否存在.5、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對(duì)照組相比是否有恢復(fù)的趨勢(shì).6、觀察統(tǒng)計(jì)治療組與對(duì)照組動(dòng)物的精神狀態(tài)或存活狀態(tài).7、組織切片觀察治療組受損組織結(jié)構(gòu)、功能細(xì)胞分布是否趨于正常.8、檢測(cè)受損組織的功能是否有所改善.9、病理切片觀察受損組織周圍炎性細(xì)胞情況,檢測(cè)

9、炎性因子分泌情況.10、受損組織中趨化因子 IL-8、CXC、MCP-1 單核趨化蛋白的含量.MSC修復(fù)壞死胰腺組織造模：處理胰腺組織,造胰腺組織壞死模型：開腹結(jié)扎胰腺組織,7-8小時(shí)后,胰尾局部組織變黑壞死,周圍有炎性細(xì)胞浸潤.治療：在胰腺未損傷部位植入胰腺DAPI標(biāo)記的胰腺M(fèi)SC細(xì)胞.檢測(cè)指標(biāo)：1、觀察胰腺組織外觀是否趨于正常,切片胰島細(xì)胞是否趨于正常；2、DAPI標(biāo)記的陽性 MSC在胰腺組織是否存在,數(shù)量多少；3、治療組和未治療組的動(dòng)物精神狀態(tài)和成活率比照；4、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對(duì)照組相比是否有恢復(fù)的趨勢(shì).5、組織切片觀察治療組受損組織結(jié)構(gòu)、功能細(xì)胞分布是否趨于正常.6、檢測(cè)受損

10、組織的功能是否有所改善.7、病理切片觀察受損組織周圍炎性細(xì)胞情況,檢測(cè)炎性因子分泌情況.8、受損組織中趨化因子 SDF1T、IL-8T、CXCT、MCP-1 T 單核趨化蛋白的含量.9、促細(xì)胞生長作用：HGF、bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子3 PDGF 血小板衍生因子T10、炎性和抗炎性因子檢測(cè)：IL-6J、TNF-a J、INF-丫 J、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖和抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生 H2O2.11、促血管生成作用：HGF肝細(xì)胞生長因子T、VEGF血管內(nèi)皮生長

11、因子T、 TGF-1 轉(zhuǎn)化生長因子T、 bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子T、 PDGF 血小板衍生因 子T、內(nèi)皮素endothelin T、表皮調(diào)節(jié)蛋白 epiregulin T等.MSC用于心血管疾病的治療在心肌堵塞、心肌缺血性損傷等模型中,MSC的治療作用表現(xiàn)為保護(hù)心肌細(xì)胞、促進(jìn)心臟祖細(xì)胞的分化增殖、抑制心臟炎癥反響、促進(jìn)心臟血管生成,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生、改善 心臟功能.檢測(cè)指標(biāo)包括：1、觀察心臟組織外觀是否趨于正常,切片心肌細(xì)胞是否趨于正常；2、移植陽性MSC在心臟受損部位是否存在,數(shù)量多少；3、治療組和未治療組的動(dòng)物精神狀態(tài)和成活率比照；4、觀察受損組織的外觀、質(zhì)地與對(duì)照組相比是否有恢復(fù)的趨

12、勢(shì).5、組織切片觀察治療組受損心臟組織結(jié)構(gòu)、功能細(xì)胞分布是否趨于正常.6、檢測(cè)受損心臟組織的功能是否有所改善.檢測(cè)神經(jīng)前體細(xì)胞NPC的增殖膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP的表達(dá).7、病理切片觀察受損心臟組織周圍炎性細(xì)胞情況,檢測(cè)炎性因子分泌情況.8、受損組織中趨化因子 IL-8、CXC、MCP -1 單核趨化蛋白的含量.9、促細(xì)胞生長作用：HGF、bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子3 PDGF 血小板衍生因子T、IGF-110、炎性和抗炎性因子檢測(cè)： IL-6J、TNF-a J、INF-丫 J、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、 IL-10 T、bFGFT、 TGF-af、 Bcl-2 T , MSC移植

13、可以減少心肌層 CD68+T細(xì)胞的增 加和減少單核細(xì)胞趨化蛋白MCP-1的表達(dá).11、促血管生成檢測(cè)：HGF肝細(xì)胞生長因子T、VEGF血管內(nèi)皮生長因子T、 TGF-1 轉(zhuǎn)化生長因子T、 bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子3 PDGF 血小板衍 生因子T、內(nèi)皮素endothelin T、表皮調(diào)節(jié)蛋白 epiregulin T等.12、造血因子分泌檢測(cè)：IL-8、GM-CSR M-CSF、TNF- “等.13、神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌檢測(cè)：IGF-1、BDNF、GDNR NGF、TIMP-1等.MSC用于肺纖維化模型在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型中,MSC移植可以抑制肺纖維化,同時(shí)MSC產(chǎn)生IL-1受體拮抗劑一種

14、抗炎性的可溶性因子,減輕博來霉素導(dǎo)致的肺損傷.雖然有一些實(shí)驗(yàn)證據(jù),但是目前MSC抑制肺臟纖維化還有爭議.檢測(cè)指標(biāo)：1、MSC抑制膠原合成作用：肺病變部位膠原的含量2、促細(xì)胞生長作用：HGF、bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子T、 PDGF 血小板衍生因子3、纖維化逆轉(zhuǎn)作用：組織金屬蛋白酶抑制劑TIMP-1 J、TGF3 J的表達(dá)4、炎性和抗炎性因子檢測(cè)：IL6J、TNEoU、INF-yJ、IL-1 3 J、一氧化氮合酶J 、IL-10 T、bFGFT、 TGF-aT、 Bcl-2 T , MSC的抗炎性作用還表現(xiàn)在抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞的增殖和抑制中性粒細(xì)胞產(chǎn)生H2O2.5、促血管生成作用：HGF肝細(xì)胞生長因子T、VEGF血管內(nèi)皮生長因子T、 TGF-1 轉(zhuǎn)化生長因子T、 bFGF 成纖維細(xì)胞生長因子T、 PDGF 血小板衍生因 子T、內(nèi)皮素endotheli