生物法和HPLC測(cè)定左氧氟沙星血藥濃度的比較

1、生物法和HPLC測(cè)定左氧氟沙星血藥濃度的比較摘要目的：建立用生物法和HPLC測(cè)定左氧氟沙星血藥濃度的方法，為臨床合理用藥提供依據(jù)。方法：生物法使用培養(yǎng)基號(hào)和金葡球菌。HPLC用300 g.L-1三氯醋酸沉淀蛋白，流動(dòng)相為甲醇0.02mol.L-1-磷酸二氫鉀溶液(37，1 mol.L-1磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0)，檢驗(yàn)波長(zhǎng)290 nm.結(jié)果：生物法測(cè)定不同濃度左氧氟沙星的平均回收率在95.90%106.68%范圍內(nèi)，日內(nèi)和日間RSD低于6%。HPLC測(cè)定不同濃度左氧氟沙星的平均回收率在97.24%101.70%范圍內(nèi)，日內(nèi)和日間RSD低于5%。6例患者以兩種方式po左氧氟沙星片劑后，用生物法和HP

2、LC測(cè)其血藥濃度，結(jié)果經(jīng)方差分析及t檢驗(yàn)分析，無(wú)顯著性差異(P0.05)。結(jié)論：生物法價(jià)廉、省時(shí)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠；HPLC靈敏度高、分析速度快、分離效果好。這兩種方法可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件選用。關(guān)鍵詞左氧氟沙星；生物法；HPLCComparison of bioassay and HPLC for the determination of levofloxacin in plasmaSi Kaiying (Si KY),Duan Jingli (Duan JL),Yan Baoxia (Yan BX) (Department of Pharmacy,The General Hospital of

3、 Da qing Oil Field,Daqing 163001)ABSTRACTOBJECTIVE:The bioassay and HPLC methods were established and compared for the determination of levofloxacin(Lev) in human plasma.METHOD:In bioassay,medium and staphylococcus aureus were used.The HPLC method was chromatographed with a mobile phase of methanol-

4、0.02mol/L potassium dihydrogen phosphate solution (37)，the sample was treated by adding 30% trichloroacetic acid to precipitate protein,and detected at 276mm.RESULTS:The average recovery of bioassay was within 95.90%106.68%,the within-day and day-to-day precisions were below 6%.The average recovery

5、of HPLC was within 97.24%101.70%,the within day and day-to-day precisions were blow 5%.Lev tablets were given to 6 patients in two ways.Drug concentrations in plasma were determined by bioassay and HPLC assay,respectively,with no significant difference (P0.05).CONCLUSION:The bioassay was simple,chea

6、p,time saving,and reliable.The HPLC method wsa rapid,sensitive,accurate.The two methods may be selected to use in actual conditions.KEY WORDSlevofloxacin,bioassay,HPLC左氧氟沙星(可樂必妥，levofloxacin，lev)為第三代喹諾酮類抗菌藥物，比氧氟沙星、環(huán)丙沙星等有更廣泛的抗菌譜，副作用發(fā)生率低，臨床應(yīng)用廣泛，適用于各種感染性疾病的治療。曾有文獻(xiàn)關(guān)于氧氟沙星人體生物利用度及藥代動(dòng)力學(xué)研究方面的報(bào)道12，本實(shí)驗(yàn)利用生物和HP

7、LC兩種方法測(cè)定左氧氟沙星的血藥濃度，并對(duì)之進(jìn)行比較，旨在探討生物測(cè)定法和HPLC測(cè)定法在抗菌藥物濃度測(cè)定中的應(yīng)用，為臨床監(jiān)測(cè)血藥濃度提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1儀器與試劑1.1儀器SP8810高效液相色譜泵：Spectra UV2 000紫外檢測(cè)器；SP4290積分儀；Spheri-5 RP-18220mm4.6mm色譜柱(美國(guó)TSP公司)。36cm26cm玻璃平盤；恒溫電熱培養(yǎng)箱。1.2試劑和藥品甲醇(分析純，北京化工廠)；磷酸二氫鉀(分析純，北京紅星化工廠)。磷酸(分析純，北京化學(xué)試劑研究所)；三氯醋酸(分析純，北京順義李遂化工廠)。金葡菌CMCC(B) 26 003(中國(guó)藥品生物制品檢定所)。培養(yǎng)

8、基號(hào)(pH6.56.6,中國(guó)藥品生物制品檢定所)。Lev對(duì)照品(日本第一制藥株式會(huì)社)。2試驗(yàn)方法2.1生物法測(cè)定血藥濃度2.1.1操作方法取金葡菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，在3537恒溫箱中培養(yǎng)24h。臨用時(shí)，用滅菌水將菌苔洗下，備用3。220ml培養(yǎng)基號(hào)在116，20min條件下消毒后均勻鋪在盤里。冷卻后，取10ml新鮮菌液倒入盤內(nèi)，均勻擴(kuò)散，吸取多余的菌液，37恒溫箱中放置5min。打孔(6mm)，間距3cm，點(diǎn)樣30l，每個(gè)樣品均加樣2次，在37恒溫箱中培養(yǎng)20h，用游標(biāo)卡尺量取抑菌圈直徑。2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作精密稱取Lev對(duì)照品，用去離子水溶解，配成濃度為1.0m

9、g.ml-1的貯備液，精密吸取Lev貯備液適量，配成2.5，3.0，4.0，8.0，12.0，16.0g.ml-1系列濃度的對(duì)照品溶液，按上述方法測(cè)定，以抑菌圈直徑(D)與濃度對(duì)數(shù)(logc)作橫、縱坐標(biāo)，得回歸方程為：logc=0.8541D-0.4876,r=0.9990。在此濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.1.3精密度和回收率考察日內(nèi)、日間精密度在同日內(nèi)和不同日間配制高、中、低3個(gè)不同濃度的血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)管各4管，同盤內(nèi)附做一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，如上法操作。由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品的濃度及回收率，求得其日內(nèi)RSD在2.40%5.65%范圍內(nèi)，日間RSD在3.55%5.83%范圍內(nèi)。人血漿中不同濃度 Le

10、v 的平均回收率在95.90%106.68%范圍內(nèi),結(jié)果見表1。本法最低檢測(cè)濃度為2g.ml-1。2.2HPLC測(cè)定血藥濃度2.2.1實(shí)驗(yàn)方法流動(dòng)相：甲醇-0.02mol.L-1磷酸二氫鉀溶液(37，1mol.ml-1磷酸調(diào)節(jié)pH=3.0),流速1.0ml.min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)290nm;積分儀衰減為8；紙速2.5mm.min-1。在以上條件下，Lev與血漿色譜峰分離良好，tR=9.09min,見1。1左氧氟沙星血清色諳A-空白血清；B-含藥血清血漿樣品處理，精密吸取人血漿樣品0.5ml，置于1.5ml刻度離心管中，加300g.L-1三氯醋酸0.2 ml，渦旋振蕩1 min，12 000r.m

11、in-1離心5 min,取上清液20L進(jìn)樣，進(jìn)行液相色譜分析。2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制作精密吸取Lev貯備液適量，配成含0.5，1.0，2.0，4.0，8.0，16.0g.ml-1系列濃度的對(duì)照品溶液，如上法測(cè)定。以檢測(cè)峰高與藥物標(biāo)準(zhǔn)濃度作線性回歸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在此濃度范圍內(nèi)Lev的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)性良好，其回歸方程為：H=874.20c-74.83，r=0.999 4。2.2.3精密度和回收率配制不同濃度的人血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)管各5管，同日進(jìn)行萃取測(cè)定，以考察方法的日內(nèi)精密度，求得其日內(nèi)精密度RSD在1.71%3.26%范圍內(nèi)；同法配制高、中、低不同濃度的Lev標(biāo)準(zhǔn)管各5管，在不同日間進(jìn)行萃取測(cè)定，求得

12、其均值，求得其日間精密度RSD在1.78%4.22%范圍內(nèi)，人血漿中不同濃度Lev的平均回收率在97.24%101.70%范圍內(nèi)，結(jié)果見表1。本法的最低檢測(cè)濃度為0.1g.ml-1。表1血漿樣品中Lev的精密度及回收率測(cè)定方法理論濃度/g.ml-1日內(nèi)日間回收率/%sRSD/%sRSD/%生物法3.03.310.195.653.030.134.33101.144.38(n=4)8.08.370.202.408.530.505.83106.686.2212.012.070.594.8811.510.413.5595.904.00HPLC1.01.000.021.971.010.044.22101

13、.702.56(n=5)3.02.900.093.262.910.051.8097.242.005.0 4.910.081.714.910.091.7898.761.112.3應(yīng)用實(shí)例 本實(shí)驗(yàn)中有6例患者以300mg,bid和200mg，tid兩種方式po Lev片劑，分別于第1天服藥后2,812h和第4天服藥前及服藥后2,812h取前臂靜脈血4ml，于-20冰箱保存?zhèn)錅y(cè)。分別用生物法和HPLC測(cè)定6例患者口服Lev后的血藥濃度，結(jié)果見表2。兩種服藥方式的血藥濃度值經(jīng)方差分析和成組t檢驗(yàn)分析，無(wú)顯著性差異(P0.05)；用兩種方法測(cè)定的結(jié)果經(jīng)配對(duì)t檢驗(yàn)分析，亦無(wú)顯著性差異(P0.05)。表2生

14、物法和HPLC測(cè)定6例患者po Lev后血藥濃度結(jié)果.g.ml-1患者編號(hào)劑量/mg,bid服藥第1天服藥第4天2h812h0h2h812h生物法 HPLC法生物法HPLC生物HPLC生物法HPLC生物法HPLC11)3002.672.232.431.545.643.695.334.735.264.9621)3002.171.971.331.282.291.363.383.313.823.0231)3002.742.161.971.782.501.683.973.713.343.3942001.761.244.434.499.9311.5415.9015.3712.2412.9352002.8

15、53.051.931.882.732.448.465.193.323.3762004.364.393.472.472.351.412.311.342.022.21x2.7582.5062.5932.2404.2403.6876.5775.7155.0004.980s0.8861.0891.1481.1723.0673.9465.0855.3773.6973.995注：1)患者服藥方法為300mg,bid3討論3.1用生物法測(cè)定時(shí)，Lev血藥濃度在2.516.0g.ml-1范圍內(nèi)的對(duì)數(shù)與抑菌圈直徑線性相關(guān)，實(shí)驗(yàn)條件達(dá)到分析要求(r=0.999 0)。本法容易操作，儀器簡(jiǎn)單，且直觀反應(yīng)藥效，選定適宜實(shí)驗(yàn)菌亦可以推廣測(cè)定其它抗生素的血藥濃度。生物測(cè)定法血漿樣品不必處理，直接點(diǎn)樣，省時(shí)、省力，費(fèi)用低廉，可成批測(cè)定?？蓮V泛用于各級(jí)各類醫(yī)院臨床抗生素濃度的監(jiān)測(cè)。3.2HPLC快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，靈敏度高，既可以用于臨床監(jiān)測(cè)血藥濃度，又能滿足藥動(dòng)學(xué)和生物利用度研究的需要，但血漿樣品的前處理比較麻煩，本實(shí)驗(yàn)用300g.L-1三氯醋酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣，取得滿意的結(jié)果。3.3實(shí)驗(yàn)中，6例患者分別以300mg，bid和200mg,tid兩種方式po Lev片劑，之后在不同時(shí)刻采血測(cè)其血藥濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)t檢驗(yàn)，無(wú)顯