微生物檢測(cè)方法-USP(共27頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查簡(jiǎn)介：下述方法能夠?qū)υ谟醒鯒l件下生長(zhǎng)的嗜溫性細(xì)菌和真菌進(jìn)行定量計(jì)數(shù)。該檢查主要是為了確定某種物質(zhì)或劑型是否符合既定的微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)以此為目的時(shí)，按照下面給出的規(guī)定進(jìn)行，包括所需的樣品數(shù)量以及按照下文規(guī)定的要求對(duì)結(jié)果進(jìn)行描述。此方法不適用于用活微生物作為活性成分的產(chǎn)品。若使用了其他的微生物程序，包括自動(dòng)方法，則應(yīng)提供其等同于藥典方法的證明。一般程序?yàn)榱吮苊馔鈦?lái)微生物的影響，必須在設(shè)定的條件下進(jìn)行微生物檢查。為避免此污染所采取的預(yù)防措施必須不影響所要進(jìn)行檢查的微生物。 如果待測(cè)樣品具有抗微生物活性，則在可能的情況下，移除或中和這種抗

2、微生物活性。如果因此而是用了鈍化劑，則必須證明其有效性及對(duì)微生物無(wú)毒性。 如果在處理樣品時(shí)使用了表面活性劑，必須證明其對(duì)微生物無(wú)毒性及與證明其所使用的鈍化劑的兼容性。計(jì)數(shù)方法用薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法。最大機(jī)率法（MPN）一般來(lái)說(shuō)最不準(zhǔn)確的微生物計(jì)數(shù)方法。但是對(duì)于生物負(fù)荷非常小的確定的產(chǎn)品來(lái)說(shuō)可能是最適合的方法。對(duì)檢查方法的選擇是基于像產(chǎn)品的本質(zhì)和微生物的限度這樣一些因素。所選擇的方法必須能夠用足夠的樣品來(lái)判斷出其是否符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。必須證明所選擇的方法的適用性。生長(zhǎng)促進(jìn)試驗(yàn)、計(jì)數(shù)方法的適用性和陰性對(duì)照一般原則必須證明檢測(cè)方法能夠從攜帶微生物的樣品中檢測(cè)出此微生物。如果在檢測(cè)過(guò)程中有了改變或會(huì)影響

3、檢測(cè)結(jié)果的產(chǎn)品的改變，則必須證明其適用性。測(cè)試菌株的準(zhǔn)備用標(biāo)準(zhǔn)化的測(cè)試菌株的穩(wěn)定混懸液或用下述規(guī)定的方法準(zhǔn)備測(cè)試菌株。使用菌種培養(yǎng)維護(hù)技術(shù)（菌種系統(tǒng)），以使從原始主菌株中移除的用于接種的微生物不大于5個(gè)片段。按照表1中所描述的方法分別對(duì)細(xì)菌和真菌的測(cè)試菌株進(jìn)行培養(yǎng)。用PH 7.0 的氯化鈉-蛋白胨緩沖液或PH 7.2 磷酸鹽緩沖液來(lái)配制測(cè)試混懸液；制備A. brasiliensis 孢子混懸液，可加入0.05%的聚山梨酯80。在2小時(shí)內(nèi)使用該混懸液或如果在28儲(chǔ)存則在24小時(shí)內(nèi)使用。作為一種替代的方法，可以配制并稀釋植物細(xì)胞A. brasiliensis或B. subtilis de 新鮮混懸

4、液，配制一份孢子的穩(wěn)定混懸液，然后用適量的此孢子混懸液進(jìn)行接種。此穩(wěn)定的孢子混懸液可在28在驗(yàn)證過(guò)的一段時(shí)間內(nèi)保存。陰性對(duì)照為了確認(rèn)檢測(cè)條件，用稀釋劑代替樣品溶液進(jìn)行陰性對(duì)照。陰性對(duì)照必須沒(méi)有微生物生長(zhǎng)。在檢測(cè)“產(chǎn)品檢測(cè)”項(xiàng)下描述的產(chǎn)品時(shí)也需要進(jìn)行陰性對(duì)照，陰性對(duì)照失敗需進(jìn)行調(diào)查。培養(yǎng)基生長(zhǎng)促進(jìn)對(duì)每一批準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基和每一批由脫水培養(yǎng)基或原料制成的培養(yǎng)基進(jìn)行檢測(cè)。在大豆酪蛋白消化肉湯和大豆酪蛋白消化瓊脂部分/培養(yǎng)皿上接種表1中規(guī)定的少量微生物（不大于100CFU），每種培養(yǎng)基使用單獨(dú)的部分/培養(yǎng)皿。在沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)皿中接種表1中規(guī)定的少量微生物（不大于100CFU），每種培養(yǎng)基使用單獨(dú)的部

5、分/培養(yǎng)皿。根據(jù)表1中的規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)。表1.檢測(cè)微生物的準(zhǔn)備和使用生長(zhǎng)促進(jìn)產(chǎn)品中計(jì)數(shù)方法的適用性微生物測(cè)試菌株的準(zhǔn)備需氣菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)需氣菌總數(shù)霉菌和酵母菌總數(shù)金黃色葡萄球菌，如ATCC6538、NCIMB9518、CIP4.83、或NBRC13276大豆酪蛋白消化瓊脂或大豆酪蛋白消化肉湯30-3518-24小時(shí)大豆酪蛋白消化瓊脂和大豆酪蛋白消化肉湯100CFU30-353天大豆酪蛋白消化瓊脂/MPN大豆酪蛋白消化肉湯100CFU30-353天綠膿桿菌，如ATCC902、NCIMB8626、CIP82.118或NBRC13275大豆酪蛋白消化瓊脂或大豆酪蛋白消化肉湯30-3518-24

6、小時(shí)大豆酪蛋白消化瓊脂和大豆酪蛋白消化肉湯100CFU30-353天大豆酪蛋白消化瓊脂/MPN大豆酪蛋白消化肉湯100CFU30-353天枯草芽孢桿菌，如ATCC6633、NCIMB8054、CIP52.62或NBRC3134大豆酪蛋白消化瓊脂或大豆酪蛋白消化肉湯30-3518-24小時(shí)大豆酪蛋白消化瓊脂和大豆酪蛋白消化肉湯100CFU30-353天大豆酪蛋白消化瓊脂/MPN大豆酪蛋白消化肉湯100CFU30-353天白色念珠菌，如ATCC10231、NCPF3179、IP48.72或NBRC1594沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯20-252-3天大豆酪蛋白消化瓊脂100CFU30-355天沙

7、氏葡萄糖瓊脂100CFU20-255天大豆酪蛋白消化瓊脂100CFU30-355天MPN: not applicable沙氏葡萄糖瓊脂100CFU20-255天黑曲霉菌，如ATCC16404、IMI、IP1431.83或NBRC9455沙氏葡萄糖瓊脂或馬鈴薯葡萄糖瓊脂20-25 5-7天或直到有好的芽孢形成大豆酪蛋白消化瓊脂100CFU30-355天沙氏葡萄糖瓊脂100CFU20-255天大豆酪蛋白消化瓊脂100CFU30-355天MPN: not applicable沙氏葡萄糖瓊脂100CFU20-255天對(duì)于固體培養(yǎng)基，由一個(gè)大于2的因子和由標(biāo)準(zhǔn)化接種物計(jì)算值得到的增長(zhǎng)必須相同。對(duì)于新制備

8、的接種物，微生物的生長(zhǎng)情況應(yīng)該和之前一批經(jīng)過(guò)檢測(cè)并驗(yàn)證的培養(yǎng)基的情況相比較。如果與之前一批經(jīng)過(guò)檢測(cè)并驗(yàn)證的培養(yǎng)基的情況相比較，微生物的生長(zhǎng)情況是明顯可見(jiàn)的，那么液體培養(yǎng)基亦適用。產(chǎn)品中計(jì)數(shù)方法的適用性制備樣品制備樣品的方法取決于待測(cè)品的物理性質(zhì)。如果以下程序均不能達(dá)到令人滿意的效果，則應(yīng)開(kāi)發(fā)其他替代的程序。水溶性待測(cè)樣品：在PH7.0的氯化鈉-蛋白胨溶液、PH7.2的磷酸鹽緩沖液或大豆酪蛋白消化肉湯中溶解或稀釋?zhuān)ㄍǔ?zhǔn)備1：10的稀釋液）待測(cè)樣品，將PH值調(diào)節(jié)至6-8。如果需要進(jìn)一步稀釋?zhuān)瑧?yīng)使用相同的稀釋劑。 不溶于水的非脂肪性樣品：在PH7.2磷酸鹽緩沖液，PH7.0的氯化鈉蛋白胨緩沖液或大

9、豆酪蛋白酶消化肉湯中制備待測(cè)品混懸液（通常按1：10稀釋?zhuān)杉尤肜?g/L的聚山梨酯這一類(lèi)表面活性劑來(lái)幫助親水性差的物質(zhì)形成懸液。如果需要調(diào)節(jié)PH到6-8。如果需要，可用同樣的稀釋劑進(jìn)一步稀釋。脂肪性產(chǎn)品：用經(jīng)過(guò)除菌過(guò)濾后的肉豆蔻酸異丙酯溶解樣品，或?qū)悠放c最小需要量的無(wú)菌聚山梨酯80或其他加熱后的無(wú)菌的無(wú)抑制性的表面活性劑混合，如果需要加熱，溫度應(yīng)不超過(guò)40，對(duì)特殊的產(chǎn)品，應(yīng)不超過(guò)45。小心混合，如果需要在水浴中保持此溫度。加入足夠量的用預(yù)熱過(guò)的稀釋劑進(jìn)行1:10稀釋后的待測(cè)樣品。小心混合，直至形成乳狀液。用含有適量無(wú)菌聚山梨酯80或其他非抑制性的表面活性劑的稀釋劑進(jìn)行連續(xù)的十倍稀釋。氣

10、溶膠中的液體或固體：在無(wú)菌條件下將待測(cè)樣品轉(zhuǎn)移至薄膜過(guò)濾器或無(wú)菌的容器中以進(jìn)行進(jìn)一步的取樣。使用全部或者每個(gè)容器中計(jì)算出的劑量作為樣品。透皮貼劑：移除透皮貼劑的保護(hù)層，將其放置在無(wú)菌的玻璃或塑料盤(pán)中，有粘性的一面向上，用一層能透氣的蓋住透皮貼劑的粘性表面以防其粘在一起，然后將貼劑轉(zhuǎn)移到適量的含有像聚山梨酯80和/或卵磷脂等鈍化劑的稀釋劑中，大力振搖至少30分鐘。接種和稀釋向按上述方法制備的樣品及對(duì)照中（無(wú)待測(cè)樣品）加入適量的微生物混懸液以得到不大于100CFU的接種物。接種物的體積應(yīng)不大于稀釋的待測(cè)樣品的體積的1%。為了證明待測(cè)樣品中可接受的微生物的回收率，必須用樣品的最低可能稀釋因子進(jìn)行檢測(cè)

11、。如果由于抗微生物活性或者溶解性差而無(wú)法用樣品的最低可能稀釋因子進(jìn)行檢測(cè)，則必須尋求其他合適的方案。若不能避免對(duì)樣品生長(zhǎng)的抑制，在中和、稀釋或過(guò)濾后應(yīng)加入等分的微生物混懸液。中和/移除抗微生物活性按照“接種和稀釋”的規(guī)定進(jìn)行稀釋的樣品中微生物的回收率及按照“產(chǎn)品中微生物的回收率”進(jìn)行培養(yǎng)，與對(duì)照中微生物的回收率進(jìn)行比較：如果生長(zhǎng)被抑制（由于因子大于2而降低），則變更該計(jì)數(shù)檢測(cè)方法的程序以保障結(jié)果的有效性。變更的程序可包括，例如：（1） 增加稀釋劑或培養(yǎng)基的體積；（2） 將特定的或一般的中和劑混入稀釋劑中；（3） 薄膜過(guò)濾；上述措施結(jié)合。中和劑：中和劑用中和樣品中的抗微生物活性（見(jiàn)表1）。最好在

12、滅菌前將其加入到所使用的稀釋劑或培養(yǎng)基中。如果使用了中和劑，必須做一個(gè)有中和劑無(wú)樣品的空白來(lái)證明中和劑的有效性及其對(duì)微生物無(wú)毒性。表2. 干擾物質(zhì)的中和劑/方法干擾物質(zhì)潛在的中和劑/方法戊二醛、汞制劑亞硫酸氫鈉酚醛樹(shù)脂、醇類(lèi)、醛、山梨酸酯稀釋劑醛糖膠季銨鹽化合物（QACs）、對(duì)羥基苯甲酸酯、二雙胍類(lèi)卵磷脂季銨鹽化合物（QACs）、碘、尼泊金類(lèi)聚山梨醇酯汞制劑硫膠質(zhì)汞制劑、鹵素、醛六代硫酸鹽EDTA鎂或鈣離子如果沒(méi)有合適的中和方法，可以假設(shè)已接種微生物的分離失敗是由于產(chǎn)品的微生物活性。這些信息表明樣品不容易被給出的微生物污染。但是，有可能這種產(chǎn)品只抑制了一些在此指定的微生物，但不抑制一些不包含在

13、測(cè)試菌株內(nèi)或不具有代表性的微生物。因此，使用與微生物生長(zhǎng)和規(guī)定的可接受標(biāo)準(zhǔn)相兼容的最大稀釋因子進(jìn)行檢測(cè)。產(chǎn)品中微生物的回收率對(duì)列出的每種微生物，應(yīng)分別進(jìn)行試驗(yàn)。只對(duì)加入測(cè)試菌株的微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)。薄膜過(guò)濾：使用標(biāo)稱(chēng)孔徑不大于0.45m，這種過(guò)濾器材質(zhì)的選擇是基于細(xì)菌保留效率不被待測(cè)樣品的組分影響這樣的理念。對(duì)列出的所有微生物，使用一個(gè)薄膜過(guò)濾器。將按照“樣品的準(zhǔn)備”、“培養(yǎng)和稀釋、”“中和/移除抗微生物活性”所規(guī)定的方法制備的適量樣品（大約1g樣品，如果測(cè)定的CFU較多的話，可減少樣品數(shù)量）移入到薄膜過(guò)濾器內(nèi)，立即過(guò)濾，用適量的稀釋劑沖洗薄膜過(guò)濾器。測(cè)定需氣菌總數(shù)（TAMC）時(shí)，將薄膜過(guò)濾器移到

14、大豆酪蛋白消化瓊脂表面上。測(cè)定霉菌及酵母菌總數(shù)（TYMC）時(shí)，將薄膜過(guò)濾器移到沙氏葡萄糖瓊脂表面上。按表1的規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)，然后計(jì)數(shù)。平皿計(jì)數(shù)法：平皿計(jì)數(shù)法對(duì)每中培養(yǎng)基至少用2個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果取其平均數(shù)。注皿法：用直徑為9cm的皮氏培養(yǎng)皿，加入1ml按照“樣品的準(zhǔn)備”、“培養(yǎng)和稀釋、”“中和/移除抗微生物活性”所規(guī)定的方法制備的樣品及15-20ml大豆酪蛋白消化瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂，這兩種培養(yǎng)基均在不大于45的條件下保存。如果使用更大的皮氏培養(yǎng)皿，瓊脂培養(yǎng)基的數(shù)量也要相應(yīng)的增加。對(duì)每種表1中列出的微生物，至少分別需要2個(gè)皮氏培養(yǎng)皿。按照表1中的規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)，用每個(gè)培養(yǎng)基計(jì)算的平均值，計(jì)算原

15、始接種物中的CFU數(shù)。表面分布法：用直徑為9cm的皮氏培養(yǎng)皿，在45時(shí)向每個(gè)培養(yǎng)基中加入15-20ml大豆酪蛋白消化瓊脂或沙氏葡萄糖瓊脂，使其凝固。如果使用更大的皮氏培養(yǎng)皿，瓊脂培養(yǎng)基的數(shù)量也要相應(yīng)的增加。干燥培養(yǎng)基，例如在層流柜中會(huì)培養(yǎng)器中。對(duì)每種表1中列出的微生物，至少分別需要2個(gè)皮氏培養(yǎng)皿。將經(jīng)過(guò)測(cè)量的不少于0.1ml的按照“樣品的準(zhǔn)備”、“培養(yǎng)和稀釋、”“中和/移除抗微生物活性”所規(guī)定的方法制備的樣品分布在培養(yǎng)基表面。按照“注皿法”的規(guī)定進(jìn)行培養(yǎng)基計(jì)數(shù)。最大機(jī)率法（MPN）：最大機(jī)率法的精確性和準(zhǔn)確度均小于薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法。霉菌的計(jì)數(shù)結(jié)果尤為不可靠。由于這種原因，在沒(méi)有其他可靠的

16、方法情況下，則在TAMC計(jì)數(shù)中可使用最大機(jī)率法。如果對(duì)使用這種方法給出了合理說(shuō)明，則按照以下規(guī)定進(jìn)行。按照“樣品的準(zhǔn)備”、“培養(yǎng)和稀釋、”“中和/移除抗微生物活性”所規(guī)定的方法，對(duì)樣品連續(xù)進(jìn)行3次10倍稀釋。對(duì)每個(gè)等級(jí)的稀釋?zhuān)?1g或1ml等分3份分別接種到3個(gè)盛有9-10ml大豆酪蛋白酶消化肉湯的試管中。如果需要，可向培養(yǎng)基中加入像聚山梨酯80一類(lèi)的表面活性劑，或如抗微生物劑一類(lèi)的鈍化劑。因此，進(jìn)行三個(gè)等級(jí)的稀釋?zhuān)残枰臃N9支試管。在30-35的條件下培養(yǎng)所有試管，不超過(guò)3天。若由于產(chǎn)品的性質(zhì)導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果的難以辨別或不確定，則在相同的肉湯或大豆酪蛋白酶消化瓊脂進(jìn)行傳代培養(yǎng)，在相同溫度及相同

17、的條件下培養(yǎng)1-2天，并以傳代培養(yǎng)的結(jié)果作為檢測(cè)結(jié)果。根據(jù)表3，確定待測(cè)樣品每克或每毫升中微生物最大幾率值。表3. 微生物最大幾率值每組試管中所觀察到的生長(zhǎng)情況每克或每毫升樣品內(nèi)的MPN95%置信限每支試管中樣品的克或毫升數(shù)0.10.010.00100030-9.400130.1-9.501030.1-100116.11.2-170206.21.2-170309.43.5-351003.60.2-171017.21.2-17102114-351107.41.3-20111114-35120114-35121155-38130165-382009.21.5-35201144-35202205-3

18、8210154-38211205-38212279-94220215-40221289-94222359-94230299-94231369-94300235-94301389-1043026416-181310439-1813117517-19931212030-36031316030-3803209318-36032115030-38032221030-40032329090-99033024040-99033146090-19803321100200-40003331100結(jié)果和說(shuō)明當(dāng)核實(shí)薄膜過(guò)濾法和平皿計(jì)數(shù)法的適用性時(shí)，樣品中測(cè)試微生物的平均值通過(guò)一個(gè)大于2的因子后，應(yīng)與按照“接種和稀

19、釋”項(xiàng)下的要求所做的對(duì)照的值一致。當(dāng)核實(shí)最大機(jī)率法的適用性時(shí)，接種物的計(jì)算值必須在對(duì)照所得結(jié)果的95%置信區(qū)間內(nèi)。如果用上述的任一方法對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果無(wú)法達(dá)到規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，可以使用與標(biāo)準(zhǔn)最接近的方法和實(shí)驗(yàn)條件來(lái)檢測(cè)樣品。樣品的檢測(cè)樣品使用量除另有規(guī)定外，取10g或10ml待測(cè)樣品。對(duì)于氣溶膠中的固體或液體，取10個(gè)單位容量。對(duì)于透皮貼劑，取10劑。對(duì)于下述活性物質(zhì)使用的樣品量會(huì)減少：每個(gè)單位劑量（如片、粒、支）小于或等于1mg，或每克或每ml（對(duì)于某些無(wú)法用單位劑量來(lái)衡量的制劑）中藥物活性物質(zhì)的含量小于 1mg。在上述情況中，所使用的待測(cè)樣品量應(yīng)不少于10個(gè)單位劑量或取用10g或10m

20、l樣品。對(duì)于用作活性成分的物質(zhì)，如果樣品量已被限制或批量很小（例如小于1000ml或1000g），測(cè)試取樣量應(yīng)為批量的1%，除非另有規(guī)定或給出合理的理由或是被批準(zhǔn)可以使用更少用量的樣品。對(duì)于批量少于200個(gè)實(shí)體的樣品（例如用作臨床試驗(yàn)的產(chǎn)品），樣品量可以減少至2個(gè)單位，如果批量少于100個(gè)實(shí)體，樣品量可減少至1個(gè)單位。對(duì)未包裝的物料或已包裝制劑以最小包裝單位隨機(jī)抽取樣品。為得到規(guī)定的取樣量，混合足夠數(shù)量的最小包裝單元來(lái)取得樣品。樣品檢測(cè)薄膜過(guò)濾使用可以移動(dòng)到培養(yǎng)基內(nèi)的過(guò)濾器。根據(jù)“生長(zhǎng)促進(jìn)試驗(yàn)和計(jì)數(shù)方法的適用性”的描述選擇合適的處理樣品的方法，將適量的樣品分別移入兩個(gè)薄膜過(guò)濾器中，立即過(guò)濾。用

21、的適宜的程序清洗過(guò)濾器。測(cè)定TAMC時(shí)，將一個(gè)薄膜過(guò)濾器移到大豆酪蛋白消化瓊脂的表面。測(cè)定TYMC時(shí)，將另一個(gè)薄膜移到沙氏葡萄糖瓊脂表面。盛有大豆酪蛋白消化瓊脂的培養(yǎng)皿在30-35培養(yǎng)3-5天，盛有沙氏葡萄糖瓊脂的培養(yǎng)皿在20-25培養(yǎng)5-7天。計(jì)算每克或每ml樣品中的CFU數(shù)。此處有一段有關(guān)透皮貼劑的檢測(cè)方法沒(méi)有翻譯出。平皿計(jì)數(shù)法注皿法：根據(jù)“生長(zhǎng)促進(jìn)試驗(yàn)和計(jì)數(shù)方法的適用性”的描述選擇合適的處理樣品的方法，對(duì)每種培養(yǎng)基的每個(gè)稀釋等級(jí)至少準(zhǔn)備兩個(gè)皮氏培養(yǎng)皿。盛有大豆酪蛋白消化瓊脂的培養(yǎng)皿在30-35培養(yǎng)3-5天，盛有沙氏葡萄糖瓊脂的培養(yǎng)皿在20-25培養(yǎng)5-7天。根據(jù)需要稀釋的等級(jí)以及TAMC

22、需要顯示的最大菌落數(shù)為250、TYMC需要顯示的最大菌落數(shù)為50等來(lái)選擇培養(yǎng)皿。用每個(gè)培養(yǎng)基的算數(shù)平均值來(lái)計(jì)算每克或每ml樣品中的CFU數(shù)。表面分布法：根據(jù)“生長(zhǎng)促進(jìn)試驗(yàn)和計(jì)數(shù)方法的適用性”的描述選擇合適的處理樣品的方法，對(duì)每種培養(yǎng)基的每個(gè)稀釋等級(jí)至少準(zhǔn)備兩個(gè)皮氏培養(yǎng)皿。按照“注皿法”項(xiàng)下的描述進(jìn)行培養(yǎng)和計(jì)算CFU數(shù)。最大機(jī)率法：根據(jù)“生長(zhǎng)促進(jìn)試驗(yàn)和計(jì)數(shù)方法的適用性”的描述選擇合適的處理樣品的方法。所有試管均在30-35培養(yǎng)3-5天。如果需要的話用適宜的程序進(jìn)行傳代培養(yǎng)。記錄每個(gè)稀釋等級(jí)的試管中微生物的生長(zhǎng)情況。根據(jù)表3來(lái)確定每克或每ml樣品中微生物的最可能數(shù)量。結(jié)果說(shuō)明大豆酪蛋白酶消化瓊脂中

23、的CFU數(shù)就視為需氣菌總數(shù)（TAMC）；若在此培養(yǎng)基中檢測(cè)到真菌的菌落，則也視為T(mén)AMC的一部分。沙氏葡萄糖瓊脂中的CFU數(shù)就視為酵母菌/霉菌總數(shù)（TYMC）；若在此培養(yǎng)基中檢測(cè)到細(xì)菌的菌落，則也視為T(mén)YMC的一部分。當(dāng)由于細(xì)菌的生長(zhǎng)致使TYMC超出了可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，就需要用到含有抗生素的沙氏葡萄糖瓊脂。用MPN方法計(jì)算出的值為T(mén)AMC。微生物質(zhì)量可接受標(biāo)準(zhǔn)描述如下：101CFU：最大可接受值=20；102CFU：最大可接受值=200；103CFU：最大可接受值=2000，等等。推薦使用的溶液及培養(yǎng)基會(huì)在控制菌的檢測(cè)中列出。非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢測(cè)：控制菌的檢測(cè)簡(jiǎn)介下述的檢測(cè)方法是用來(lái)限制或確定沒(méi)有

24、按所描述的條件可檢測(cè)到的控制菌存在。這些方法最初是用來(lái)確定一種物質(zhì)或劑型是否符合既定的微生物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)用作此種目的時(shí)，請(qǐng)按下述說(shuō)明程序進(jìn)行，包括需要的樣品數(shù)及按照下述的要求對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行說(shuō)明。其他的微生物程序包括自動(dòng)的方法，有可能會(huì)被用到，這需要證明這些方法等效于藥典的方法。一般程序按照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”所述對(duì)樣品進(jìn)行處理。如果待測(cè)樣品有抗菌活性，需要按照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”的要求除去或中和這種抗菌活性。如果在準(zhǔn)備樣品時(shí)使用了表面活性劑，那么就需要按照“非非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”.的要求證明這些表面活性劑對(duì)微生物是沒(méi)有毒性的，以及他們與

25、所使用的鈍化劑是可以兼容的。培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)和抑制特性、檢測(cè)的適用性及陰性控制必須證明使用的檢測(cè)方法能夠從待測(cè)樣品中檢測(cè)出微生物的存在。如果檢測(cè)方法有改變或引入了會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的樣品，則需要證明方法的適用性。檢測(cè)菌株的準(zhǔn)備使用下述的標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)菌株。使用菌種培養(yǎng)保養(yǎng)技術(shù)（菌種系統(tǒng)），以使用于培養(yǎng)的微生物從原始主菌種中移除的片段不大于5個(gè)片段，。需氧微生物用大豆酪蛋白消化肉湯或大豆酪蛋白消化瓊脂分別培養(yǎng)每種檢測(cè)菌株，在30-35培養(yǎng)18-24小時(shí)。用沙氏葡萄糖瓊脂或沙氏葡萄糖肉湯在20-25單獨(dú)培養(yǎng)白色念珠菌菌株2-3天。金黃色葡萄球菌例如ATCC6538、NCIBM9518、CIP4.83或N

26、BRC13276綠膿假單胞菌例如ATCC9027，NCIMB8626、CIP82.118或NBRC13275大腸埃希菌ATCC8739，NCIMB8545、CIP53.126或NBRC3972鼠傷寒沙門(mén)氏菌，或作為可供選擇的例如ATCC14028Abony沙門(mén)氏菌例如 NBRC、NCTC6017、CIP80.39白色念珠菌例如ATCC10231、NCPF3179、IP48.72或NBRC1594用PH7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖液或PH7.2的磷酸鹽緩沖液制備檢測(cè)混懸液。在2小時(shí)內(nèi)使用該混懸液，如果在2-8貯存的話，在24小時(shí)內(nèi)使用。梭狀芽孢桿菌用產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌，例如ATCC11437(NB

27、RC14293，NCIMB12343，CIP)或ATCC19404(NCTC532或 CIP79.3)或NBRC14293。在30-35無(wú)氧條件下，用梭狀芽胞桿菌強(qiáng)化培養(yǎng)基培養(yǎng)梭狀芽孢桿菌檢測(cè)菌株24-48小時(shí)。作為一個(gè)可供選擇的方法，準(zhǔn)備及稀釋一個(gè)新的用作接種的穩(wěn)定的Cl.sporogenes植物細(xì)胞混懸液。在驗(yàn)證過(guò)的周期內(nèi)這個(gè)穩(wěn)定的混懸液可以在2-8保存。 陰性對(duì)照為了證實(shí)檢測(cè)條件，用選定的稀釋劑代替樣品進(jìn)行陰性對(duì)照，陰性對(duì)照必須無(wú)微生物生長(zhǎng)。在檢測(cè)“樣品檢測(cè)”項(xiàng)下描述的樣品時(shí)也需要進(jìn)行陰性對(duì)照。失敗的陰性對(duì)照需要進(jìn)行調(diào)查。培養(yǎng)基的生長(zhǎng)促進(jìn)和抑制特性測(cè)試每一批現(xiàn)成的培養(yǎng)基及每一批用脫水培養(yǎng)

28、基或原料制成的培養(yǎng)基。照表1的描述來(lái)驗(yàn)證相關(guān)培養(yǎng)基的特性。表1. 培養(yǎng)基生長(zhǎng)促進(jìn)、抑制及指示特性表2.6.13.1培養(yǎng)基生長(zhǎng)促進(jìn)、抑制及指示特性測(cè)試/培養(yǎng)基特性測(cè)試菌株耐膽汁的革蘭氏陰性菌檢測(cè)腸道菌濃縮肉湯-莫塞爾生長(zhǎng)促進(jìn)大腸埃希菌銅綠假單胞菌生長(zhǎng)抑制金黃色葡萄球菌紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)+指示大腸埃希菌銅綠假單胞菌大腸埃希菌檢測(cè)麥康凱肉湯生長(zhǎng)促進(jìn)大腸埃希菌生長(zhǎng)抑制金黃色葡萄球菌麥康凱瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)+指示大腸埃希菌沙門(mén)氏菌檢測(cè)綠沙門(mén)氏菌濃縮肉湯生長(zhǎng)促進(jìn)鼠傷寒沙門(mén)氏菌Abony沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)抑制金黃色葡萄球菌戊醛糖、賴氨酸、脫氧膽酸瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)+指示鼠傷寒沙門(mén)氏菌Abony沙門(mén)氏菌綠膿假單胞菌檢測(cè)

29、溴棕三甲銨瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)銅綠假單胞菌生長(zhǎng)抑制大腸埃希菌金黃色葡萄球菌檢測(cè)甘露醇鹽瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)+指示金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)抑制大腸埃希菌梭狀芽胞桿菌檢測(cè)梭狀芽胞桿菌強(qiáng)化培養(yǎng)基生長(zhǎng)促進(jìn)Cl.sporogenes哥倫比亞瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)Cl.sporogenes白色念珠菌檢測(cè)沙氏葡萄糖肉湯生長(zhǎng)促進(jìn)白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂生長(zhǎng)促進(jìn)+指示白色念珠菌液體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)特性試驗(yàn)用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基接種少量的（不超過(guò)100CFU）適當(dāng)?shù)奈⑸铮谝?guī)定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間。清晰可見(jiàn)的微生物的生長(zhǎng)情況應(yīng)與先前試驗(yàn)所觀察到的結(jié)果及已批準(zhǔn)批次的培養(yǎng)基得到的結(jié)果是一致的。固體培養(yǎng)基促生長(zhǎng)特性試驗(yàn)：用表面分布法（非

30、無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查中的平皿計(jì)數(shù)法），每個(gè)培養(yǎng)基接種少量的（不超過(guò)100CFU）適當(dāng)?shù)奈⑸铮谝?guī)定溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不大于規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間。清晰可見(jiàn)的微生物的生長(zhǎng)情況應(yīng)與先前用已批準(zhǔn)批次的培養(yǎng)基試驗(yàn)所觀察到的結(jié)果是一致的。液體或固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)抑制特性試驗(yàn)：用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基接種至少100CFU適當(dāng)?shù)奈⑸铮谝?guī)定的溫度下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不少于規(guī)定的最長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，應(yīng)觀察不到所測(cè)試的微生物的生長(zhǎng)情況。指示特性試驗(yàn)：用表面展開(kāi)法用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基接種少量（不超過(guò)100CFU）適當(dāng)?shù)奈⑸?，在?guī)定的溫度下培養(yǎng)在規(guī)定范圍內(nèi)的一段時(shí)間，菌落的外觀及指示反應(yīng)應(yīng)與先前用已批準(zhǔn)批次的培養(yǎng)基試驗(yàn)得到的結(jié)

31、果是一致的。檢測(cè)方法的適用性按照“樣品檢測(cè)”項(xiàng)下所描述的相應(yīng)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，混合時(shí)在規(guī)定的生長(zhǎng)培養(yǎng)基內(nèi)加入測(cè)試菌株，分別培養(yǎng)每個(gè)測(cè)試菌株。在已接種的測(cè)試準(zhǔn)備時(shí)加入不多于100CFU的微生物。按照“樣品檢測(cè)”項(xiàng)下的相應(yīng)內(nèi)容進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)時(shí)間為規(guī)定的最短培養(yǎng)時(shí)間?？刂凭仨氂谩皹悠窓z測(cè)”項(xiàng)下描述的指示反應(yīng)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。任何抗菌性都導(dǎo)致需要對(duì)檢測(cè)程序進(jìn)行修改（見(jiàn)非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查中中和/移除抗微生物活性項(xiàng)下的規(guī)定）。如果用規(guī)定的方法無(wú)法中和待測(cè)樣品的抗菌活性，那就假設(shè)這種微生物在樣品中不存在。樣品檢測(cè)耐膽汁的革蘭氏陰性菌樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)：照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”

32、中所述，取不少于1g的被檢測(cè)樣品進(jìn)行1:10的稀釋?zhuān)么蠖估业鞍紫鉁珵橄♂寗?，混合并?0-25培養(yǎng)一段時(shí)間至使細(xì)菌復(fù)活，但不致繁殖（通常為2小時(shí)，但不大于5小時(shí)）。不存在的檢測(cè)：除另有規(guī)定外，取按“樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)”處理后相當(dāng)于1g樣品的體積，接種到腸道菌濃縮肉湯-莫塞爾中。在30-35培養(yǎng)24-48小時(shí)。用紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂在30-35傳代培養(yǎng)18-24小時(shí)。如果沒(méi)有菌落生長(zhǎng)表示產(chǎn)品符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。定量檢查選擇和傳代培養(yǎng)：將適量按“樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)”所述制備樣品和/或分別將含有0.1g、0.01g和0.001g（或0.1ml、0.01ml及0.001ml）待測(cè)樣品的稀釋溶液接種到腸道菌濃

33、縮肉湯-莫塞爾，在30-35培養(yǎng)24-48小時(shí)。再用紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂在30-35傳代培養(yǎng)18-24小時(shí)。說(shuō)明：有菌落生長(zhǎng)為陽(yáng)性結(jié)果。記錄顯示陽(yáng)性結(jié)果的最小樣品數(shù)量及顯示陰性結(jié)果的最大樣品數(shù)量，根據(jù)表2確定細(xì)菌的可能數(shù)量。表2. 結(jié)果說(shuō)明不同樣品數(shù)量的結(jié)果每克或每毫升樣品中可能的細(xì)菌數(shù)0.1g或0.1ml0.01g或0.01ml0.001g或0.001ml+103103 但102102 但1010大腸埃希菌樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)：照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”所述，取不少于1g的被檢測(cè)樣品進(jìn)行1：10的稀釋?zhuān)?0ml或相當(dāng)于1g或1ml的數(shù)量接種到適量的（照“檢測(cè)方法適用性”項(xiàng)下的描述

34、確定）的大豆酪蛋白消化肉湯上，混合，在30-35培養(yǎng)18-24h。選擇和繼代培養(yǎng)：振搖容器，將1ml大豆酪蛋白消化肉湯加入到100ml 麥康基肉湯中，在42-44培養(yǎng)24-48h。再用盛有麥康基瓊脂的培養(yǎng)皿在30-35傳代培養(yǎng)18-72小時(shí)。說(shuō)明：有菌落生長(zhǎng)表示有大腸埃希菌存在的可能，這可以通過(guò)鑒別試驗(yàn)確定。如果沒(méi)有菌落生長(zhǎng)或鑒別試驗(yàn)呈陰性表示產(chǎn)品符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。沙門(mén)氏菌樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)：照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”所述，取不少于10g或10ml的樣品接種到一定數(shù)量（根據(jù) “檢測(cè)方法適用性”項(xiàng)下的描述確定）的大豆酪蛋白消化肉湯上，混合，在30-35培養(yǎng)18-24h。選擇和繼代培養(yǎng)：

35、將0.1ml大豆酪蛋白消化肉湯到10ml綠沙門(mén)氏菌濃縮肉湯中，在30-35培養(yǎng)18-24h。用戊醛糖、賴氨酸和脫氧膽酸瓊脂在30-35傳代培養(yǎng)18-48h。說(shuō)明：發(fā)育良好的、有或沒(méi)有黑色中心的紅色菌落都表示沙門(mén)氏菌存在的可能性，這可以通過(guò)鑒別試驗(yàn)確定。如果所描述的這種類(lèi)型的菌落不存在或鑒別試驗(yàn)呈陰性，表示產(chǎn)品符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。綠膿桿菌樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)：照非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”所述，取不少于1g的被檢測(cè)樣品進(jìn)行1：10的稀釋?zhuān)?0ml或相當(dāng)于1g或1ml的數(shù)量接種到一定數(shù)量（根據(jù) “檢測(cè)方法適用性”項(xiàng)下的描述確定）的大豆酪蛋白消化肉湯上，混合。當(dāng)檢測(cè)透皮貼劑時(shí)，用無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾相當(dāng)

36、于1劑待測(cè)樣品容量的樣品（見(jiàn)非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查中制備樣品項(xiàng)下透皮貼劑的描述），接種到100ml大豆酪蛋白消化肉湯上，在30-35培養(yǎng)18-24h。選擇和繼代培養(yǎng)：用溴棕三甲銨瓊脂在30-35傳代培養(yǎng)18-72h。說(shuō)明：有菌落生長(zhǎng)表示有綠膿桿菌存在的可能性，這可以通過(guò)鑒別試驗(yàn)確定。如果沒(méi)有所描述的菌落生長(zhǎng)或核實(shí)性的鑒別試驗(yàn)呈陰性，表示產(chǎn)品符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。金黃色葡萄球菌樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)：照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”所述，取不少于1g的被檢測(cè)樣品進(jìn)行1：10的稀釋?zhuān)?0ml或相當(dāng)于1g或1ml的數(shù)量接種到一定數(shù)量（根據(jù) “檢測(cè)方法適用性”項(xiàng)下的描述確定）的大豆酪蛋白消

37、化肉湯上，混勻。當(dāng)檢測(cè)透皮貼劑時(shí)，用無(wú)菌過(guò)濾膜過(guò)濾相當(dāng)于1劑待測(cè)樣品容量的樣品（見(jiàn)非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查中制備樣品項(xiàng)下透皮貼劑的描述），接種到100ml大豆酪蛋白消化肉湯上，在30-35培養(yǎng)18-24h。選擇和繼代培養(yǎng)：用甘露醇鹽瓊脂在30-35傳代培養(yǎng)18-72h。說(shuō)明：如果有被黃色區(qū)域包圍的黃色或白色菌落生長(zhǎng)則表示有金黃色葡萄球菌存在的可能性，通過(guò)鑒別試驗(yàn)確定。如果沒(méi)有所描述的菌落生長(zhǎng)或核實(shí)性的鑒別試驗(yàn)呈陰性，表示產(chǎn)品符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。梭狀芽胞桿菌樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)：照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”所述，取不少于2g或2ml的被檢測(cè)樣品進(jìn)行1：10的稀釋(最小總體積為20

38、ml)，將樣品分為2份，每份最少應(yīng)為10ml。一份在80加熱 10分鐘后迅速冷卻，一份不加熱。選擇和繼代培養(yǎng)：兩份樣品各取10ml或相當(dāng)于1g或1ml的數(shù)量接種到一定數(shù)量（根據(jù) “檢測(cè)方法適用性”項(xiàng)下的描述確定）的梭狀芽胞桿菌強(qiáng)化培養(yǎng)基上。在無(wú)氧條件下以30-35培養(yǎng)48h。培養(yǎng)結(jié)束后，用哥倫比亞瓊脂在無(wú)氧條件下以30-35傳代培養(yǎng)48-72h。說(shuō)明：出現(xiàn)無(wú)氧生長(zhǎng)的對(duì)過(guò)氧化氫酶顯陰性反應(yīng)的桿狀菌（有或無(wú)內(nèi)孢子）表示有梭狀芽胞桿菌存在。通過(guò)鑒別試驗(yàn)確定。如果沒(méi)有所描述的菌落生長(zhǎng)或核實(shí)性的鑒別試驗(yàn)呈陰性，表示產(chǎn)品符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。白色念珠菌樣品準(zhǔn)備和預(yù)培養(yǎng)：照“非無(wú)菌產(chǎn)品微生物檢查：微生物計(jì)數(shù)檢查”所

39、述，取10ml或不少于相當(dāng)于1g或1ml樣品量的樣品接種到100ml沙氏葡萄糖肉湯上，混合，在30-35培養(yǎng)3-5天。選擇和繼代培養(yǎng)：用沙氏葡萄糖瓊脂在30-35傳代培養(yǎng)24-48h。說(shuō)明：出現(xiàn)白色菌落表示有白色念珠菌存在的可能，這通過(guò)鑒別試驗(yàn)確定。如果沒(méi)有所描述的菌落生長(zhǎng)或核實(shí)性的鑒別試驗(yàn)呈陰性，表示產(chǎn)品符合試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。推薦的溶液和培養(yǎng)基注：該部分給出了一些信息以下溶液和培養(yǎng)基在檢測(cè)藥典對(duì)其規(guī)定的微生物污染時(shí)是令人滿意的。在證明其適用性后也可以使用其他的培養(yǎng)基。備用緩沖溶液：取34g磷酸二氫鉀，置1000ml 容量瓶中，用500ml純化水溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH至7.20.2，再加純化水至刻度

40、線，混勻。分裝于適宜的容器中，滅菌。在2-8存放。PH為7.2的磷酸鹽緩沖液：用備用緩沖溶液與純化水混合（體積比1：800 ），滅菌。PH為7.0的氯化鈉-蛋白胨緩沖溶液磷酸二氫鉀3.6g磷酸氫二鈉 7.2g， 等于0.067M的磷酸氯化鈉 4.3g蛋白胨（肉或酪蛋白）1.0g純化水1000ml以驗(yàn)證過(guò)的周期在高壓蒸氣滅菌器滅菌。大豆酪蛋白消化肉湯胰腺消化酪蛋白 17.0g木瓜酶消化大豆3.0g氯化鈉5.0g磷酸二價(jià)堿2.5g水合葡萄糖2.5g純化水 1000ml調(diào)節(jié)PH值，使其滅菌后在25時(shí)PH值為7.30.2。以驗(yàn)證過(guò)的周期在高壓蒸氣滅菌器滅菌。大豆酪蛋白消化瓊脂胰腺消化酪蛋白 15.0g

41、木瓜酶消化大豆5.0g氯化鈉5.0g瓊脂15.0g純化水 1000ml調(diào)節(jié)PH值，使其滅菌后在25時(shí)PH值為7.30.2。以驗(yàn)證過(guò)的周期在高壓蒸氣滅菌器滅菌。沙氏葡萄糖瓊脂右旋糖（葡萄糖）40.0g胃蛋白酶消化動(dòng)物組織 和胰腺消化酪蛋白混合物（1:1）10.0g瓊脂15.0g純化水1000ml 調(diào)節(jié)PH值，使其滅菌后在25時(shí)PH值為5.60.2。以驗(yàn)證過(guò)的周期在高壓蒸氣滅菌器滅菌。馬鈴薯葡萄糖瓊脂馬鈴薯浸出物200g右旋糖（葡萄糖）20.0g瓊脂 15.0g純化水1000ml調(diào)節(jié)PH值，使其滅菌后在25時(shí)PH值為5.60.2。以驗(yàn)證過(guò)的周期在高壓蒸氣滅菌器滅菌。沙氏葡萄糖肉湯右旋糖20.0g胃蛋白酶消化動(dòng)物組織 和胰腺消化酪蛋白混合物（1:1）10.0g純化水 1000ml調(diào)節(jié)PH值，使其滅菌后在25時(shí)PH值為5.60.2。以驗(yàn)證過(guò)的周期在高壓蒸氣滅菌器滅菌。腸道菌濃縮肉湯-莫塞爾胰腺消化明膠10.0g水合葡萄糖5.0g脫水牛膽汁20.0g磷酸二氫鉀2.0g磷酸氫二鈉二