生物競賽必備生物技術(shù)知識點

1、平邑一中高58級生命科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)知識點整理【2017年聯(lián)賽】22. 測序 逆轉(zhuǎn)錄PCR：以mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增，獲得目的基因或檢測基因表達(dá)。缺陷：檢測基因數(shù)目有限。 基因芯片技術(shù)：二維DNA探針陣列，用于基因檢測工作?？赏瑫r快速準(zhǔn)確地分析數(shù)以千計的基因組信息。 第二代測序技術(shù)（基本原理：邊合成邊測序）：Sanger等測序方法（Sanger法是根據(jù)核苷酸在某一固定的點開始，隨機在某一個特定的堿基處終止，并且在每個堿基后面進(jìn)行熒光標(biāo)記，產(chǎn)生以A、T、C、G結(jié)束的四組不同長度的一系列核苷酸，然后在尿素變性的PAGE膠上電泳進(jìn)行檢測，從而獲得

2、可見DNA堿基序列的一種方法。在分子生物學(xué)研究中，DNA的序列分析是進(jìn)一步研究和改造目的基因的基礎(chǔ)。是目前用于DNA測序的主要技術(shù)。） 第三代測序技術(shù)（單分子測序技術(shù)）：高通量測序，應(yīng)用于基因表達(dá)的檢測。23. 分離純化蛋白 凝膠過濾層析法：利用具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的顆粒的分子篩作用，根據(jù)被分離樣品中各組分相對分子質(zhì)量大小的差異進(jìn)行洗脫分離的一項技術(shù)。又稱為排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖（如葡聚糖或瓊脂糖）類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。也叫做分子排阻層析。一種利用

3、帶孔凝膠珠作基質(zhì)，按照分子大小分離蛋白質(zhì)或其它分子混合物的層析技術(shù)。 一般是大分子先流出來，小分子后流出來。 親和層析：利用生物大分子與某些相對應(yīng)的專一分子特異識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離生物大分子的層析方法。只需一步處理即可得到純度較高的某種蛋白質(zhì)。它是根據(jù)不同蛋白質(zhì)對特定配體的特異而非共價結(jié)合的能力不同進(jìn)行蛋白質(zhì)分離的，將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相 吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)

4、合的蛋白質(zhì)洗脫下來，這種分離純化蛋白質(zhì)的方法稱為親和層析。Ø 補充：固相是指由固體組成的相。相，是物理學(xué)名詞。成份、結(jié)構(gòu)相同的組織統(tǒng)稱為相。與液相反應(yīng)一樣，固相反應(yīng)的發(fā)生起始于兩個反應(yīng)物分子的擴散接觸，接著發(fā)生化學(xué)作用，生成產(chǎn)物分子。固相化學(xué)研究固體物質(zhì)的制備、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及應(yīng)用。Ø 洗脫液是一種交換樹脂后所得到的溶液，產(chǎn)生方式為再生液流過已飽和的離子。洗脫液的選擇：洗脫液可選擇水、甲醇、乙醇、丙酮、不同濃度的酸堿液等。根據(jù)吸附作用的強弱可選擇不同的洗脫液或不同濃度的同一溶劑對各類成分進(jìn)行粗分。其一般方法如下：用適量水洗，洗下單糖、鞣質(zhì)、低聚糖、多糖等極性物質(zhì)，用薄層色譜檢識

5、，防止極性大的皂苷被洗下；7O%乙醇洗，洗脫液中主要為皂苷，但也含有酚性物質(zhì)、糖類及少量黃酮，實驗證明30%乙醇不會洗下大量的黃酮類化合物；3%5%堿溶液洗，可洗下黃酮、有機酸、酚性物質(zhì)和氨基酸；10%酸溶液洗，可洗下生物堿、氨基酸；丙酮洗，可洗下中性親脂性成分。 離子交換層析:離子交換層析中，基質(zhì)是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負(fù)電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用于蛋白質(zhì)的分離純化。由于蛋白質(zhì)也有等電點，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有負(fù)電荷的蛋白質(zhì)，所以這類蛋白質(zhì)被留在柱子上，然后通過提高洗脫液中的鹽濃度

6、等措施，將吸附在柱子上的蛋白質(zhì)洗脫下來。結(jié)合較弱的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質(zhì)結(jié)合帶有正電荷的蛋白質(zhì)，結(jié)合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。 紙層析法：依據(jù)極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機溶劑作為流動相。由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴散速度不同，從而達(dá)到分離的目的。 總結(jié)：親和層析、離子交換層析和紙層析均能分離純化蛋白，不能測定其分子量。凝膠過濾層析均可。24.測定蛋白質(zhì)及其各亞基分子量 凝膠過濾層析：測定蛋白質(zhì)的分子量，未破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以測整個寡聚蛋白質(zhì)的分子量。 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（與凝膠過濾層析同理）

7、：或稱為活性電泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等變性劑的條件下，對保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳：十二烷基硫酸鈉（SDS）作為陰離子表面活性劑，使蛋白質(zhì)變性解離成單一亞基，可用以測定寡聚蛋白質(zhì)的各個亞基的分子量。 核磁共振：研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。 等電聚焦電泳：利用蛋白質(zhì)兩性解離及等電點的特征，測定蛋白質(zhì)等電點。【2018年聯(lián)賽】2. Southern印跡雜交：進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方法。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則特異性地雜交形成雙鏈。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制

8、性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。 Northern雜交：利用DNA可以與RNA進(jìn)行分子雜交來檢測特異性RNA的技術(shù)，首先將RNA混合物按它們的大小和分子量通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，分離出來的RNA轉(zhuǎn)至尼龍膜或硝酸纖維素膜上，再與放射性標(biāo)記的探針雜交，通過雜交結(jié)果可以對表達(dá)量進(jìn)行定性或定量。RNA混合物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離得到的RNA轉(zhuǎn)膜與放射性標(biāo)記的探針雜交 結(jié)果分析。 蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗Wester

9、n Blot）：它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細(xì)胞或生物組織樣品進(jìn)行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細(xì)胞或組織中表達(dá)情況的信息。用于蛋白質(zhì)的定量和定性。 實時熒光定量PCR技術(shù)（Real time PCR）：是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。通過逆轉(zhuǎn)錄過程得到的cDNA模板量與原mRNA的豐度相關(guān)，確定cDNA含量也就確定了對應(yīng)mRNA豐度。4. 觀察蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)定位的方法 熒光顯微鏡 免疫熒光技術(shù)（使用熒光

10、標(biāo)記的抗體） 將EGFP(GFP)蛋白基因連接到目標(biāo)蛋白的基因上 電鏡 免疫膠體金：在抗體上添加膠體金粒，吸附在目標(biāo)蛋白上，電鏡下電子難以穿透金粒，故顯示黑色。14-20題組： 免疫共沉淀：研究蛋白質(zhì)相互作用。在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)間的相互作用的復(fù)合體被保留了下來。23.蛋白質(zhì)分離純化 超濾：可理解為加壓后的滲透。對半透膜內(nèi)的溶液加壓，小分子能透過半透膜，在壓力作用下滲出；大分子蛋白不能透過半透膜而被富集。常用于蛋白質(zhì)除鹽。24.分離純化中引起蛋白質(zhì)變性的因素 低溫有機溶劑法：分離純化蛋白質(zhì)，通常不變性。31.用來研究生物的基因表達(dá)情況的高通量實驗技術(shù) 基因表達(dá)情況檢測方法：檢測RNA或Pr。 全基因組重測序：全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個體或群