實(shí)驗(yàn)八PCR產(chǎn)品純化及定向克隆-09級(jí)ppt課件

1、實(shí)驗(yàn)八實(shí)驗(yàn)八 PCR產(chǎn)品純化及定向克隆產(chǎn)品純化及定向克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用學(xué)習(xí)并掌握基因工程操作技術(shù)中最常用的的DNA純化和連接方法；鞏固純化和連接方法；鞏固DNA酶切的酶切的操作。操作。 二、實(shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理 PCR產(chǎn)物一般都含有過量的引物、產(chǎn)物一般都含有過量的引物、Taq酶及酶及dNTP等成分，直接影響后續(xù)的基因操等成分，直接影響后續(xù)的基因操作，利用苯酚作，利用苯酚/氯仿、氯仿依次抽提反應(yīng)體氯仿、氯仿依次抽提反應(yīng)體系中的酶，然后在酸性條件下用乙醇沉淀系中的酶，然后在酸性條件下用乙醇沉淀DNA。 根據(jù)實(shí)驗(yàn)六所用的根據(jù)實(shí)驗(yàn)六所用的PCR引物，其產(chǎn)品

2、的引物，其產(chǎn)品的5和和3末端分別具有末端分別具有EcoR I和和Not I酶切位點(diǎn)，酶切位點(diǎn)，而載體而載體pET32的多克隆位點(diǎn)中也有此兩個(gè)酶的多克隆位點(diǎn)中也有此兩個(gè)酶切位點(diǎn)。因此，若將切位點(diǎn)。因此，若將PCR產(chǎn)物與載體分別用產(chǎn)物與載體分別用EcoR I和和Not I進(jìn)行雙酶切，所得的產(chǎn)物相進(jìn)行雙酶切，所得的產(chǎn)物相應(yīng)末端正好互補(bǔ)，可用應(yīng)末端正好互補(bǔ)，可用T4 DNA連接酶在體連接酶在體外進(jìn)行連接。外進(jìn)行連接。正向引物正向引物P1） EcoRI 5-CGCGAATTCATGGCAGATCAGCTCACCGATGATC-3反向引物反向引物P2）：）： Not I 5-AGAGCGGCCGCCTTT

3、GCCATCATAACTTTGACAAA-3三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑三、實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑1、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒載體實(shí)驗(yàn)二提取的質(zhì)粒載體pET32 實(shí)驗(yàn)七的實(shí)驗(yàn)七的PCR產(chǎn)品以及實(shí)驗(yàn)八的產(chǎn)品以及實(shí)驗(yàn)八的RT-PCR產(chǎn)品產(chǎn)品2、主要試劑、主要試劑 限制性核酸內(nèi)切酶：限制性核酸內(nèi)切酶：EcoR I和和Not I T4 DNA連接酶連接酶 苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇、氯仿、醋酸鈉異戊醇、氯仿、醋酸鈉pH5.2）、）、 無水乙醇、無水乙醇、70%乙醇等乙醇等四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1、PCR產(chǎn)品的純化產(chǎn)品的純化每組同學(xué)的每組同學(xué)的PCR和和RT-PCR產(chǎn)品合并，約產(chǎn)品合并，約130l，

4、轉(zhuǎn)入，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，向離心管中，向PCR產(chǎn)品產(chǎn)品中加入中加入150l苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇，旋渦混合，異戊醇，旋渦混合，14000 rpm離心離心5 min；將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入150l氯仿，氯仿，旋渦混合，旋渦混合，14000 rpm離心離心5 min；再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加10l醋酸醋酸鈉和鈉和250l無水乙醇，混勻后，離心管插無水乙醇，混勻后，離心管插入冰中放置入冰中放置 30 min； 在在4下下14000 rpm離心離心10 min，去除上清，去除上清，觀察觀察DNA沉淀。沉淀。加加20l滅菌

5、水溶解滅菌水溶解DNA，備用。，備用。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟2、PCR產(chǎn)品與載體產(chǎn)品與載體pET32的雙酶切的雙酶切 分別在兩個(gè)分別在兩個(gè)1.5mL離心管中準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)離心管中準(zhǔn)備雙酶切反應(yīng)混合液?；旌弦骸. 10 H buffer 5l B. 10 H buffer 5l 0.1% BSA 5l 0.1% BSA 5l EcoR 2l EcoR 2l Not 2l Not 2l PCR產(chǎn)品產(chǎn)品 20l pET32載載體體 約約2g 滅菌蒸餾水滅菌蒸餾水 16l 加滅菌蒸餾水加滅菌蒸餾水至總體積至總體積50l 將上述兩個(gè)離心管內(nèi)的混合物輕輕混勻，將上述兩個(gè)離心管內(nèi)的混合物輕輕混勻，37水

6、浴酶切水浴酶切3小時(shí)。小時(shí)。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟3、酶切產(chǎn)品的純化、酶切產(chǎn)品的純化 酶切后的酶切后的PCR產(chǎn)品和載體合并產(chǎn)品和載體合并 (約約100l )，加，加入入100l苯酚苯酚/氯仿氯仿/異戊醇，旋渦混合，異戊醇，旋渦混合，14000 rpm離心離心5 min；將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加入100l氯仿，氯仿，旋渦混合，旋渦混合，14000 rpm離心離心5 min；再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加再將上層水相轉(zhuǎn)移至新離心管，加10l醋酸鈉醋酸鈉和和250l無水乙醇，混勻后，離心管插入冰無水乙醇，混勻后，離心管插入冰中放置中放置 30 min； 在在4下下

7、14000 rpm離心離心10 min，去除上清；，去除上清；加入加入500l 70%乙醇洗滌乙醇洗滌DNA沉淀，在沉淀，在4下下14000 rpm離心離心5min，去除上清，空氣干燥；，去除上清，空氣干燥；加加8l滅菌水溶解滅菌水溶解DNA，備用。，備用。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 4、目的基因、目的基因(CaM5)與載體與載體(pET32)的連接的連接 在滅菌的在滅菌的PCR管中依次加入：管中依次加入： 10 T4 DNA Ligase buffer 1l T4 DNA Ligase 1l PCR產(chǎn)品和產(chǎn)品和pET32 8l 將混合物輕輕混勻，將混合物輕輕混勻，16連接過夜。連接過夜。第二天，從第二天，從PCR儀中取出連接產(chǎn)