實時RT_PCR基因表達相對定量REST_軟件分析與2_CT_法比較

1、文章編號（）基礎(chǔ)研究論著）實時基因表達相對定量"軟件分析與（法比較庾蕾，劉建平，莊志雄，楊淋清，張仁利，葉小明，程錦泉（深圳市疾病預(yù)防控制中心分子生物學(xué)研究室，深圳；華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，武漢）摘要】目的【利用實時技術(shù)建立一種簡便、準確的基因表達相對定量方法。方法以正常的人支氣管上皮細胞株（）為模板倍系列稀釋，分別作聚合酶（）和磷酸甘油醛脫氫酶（）基因標(biāo)準曲線。以不同劑量反式二羥環(huán)氧笨并芘（）誘導(dǎo)的、轉(zhuǎn)化的及肺癌細胞株（）為模板，進行實時定量。以基因作為內(nèi)參照，進行基因表達）相對定量。實驗數(shù)據(jù)分別采用（法及"軟件分析。結(jié)果倍系列稀釋法制作的標(biāo)準曲線，呈現(xiàn)較好）

2、法計算出的表達的線型關(guān)系（）。及基因擴增效率分別為和。采用（結(jié)論比值均比"軟件分析高。定量分析手段。實時技術(shù)結(jié)合"軟件分析是一種簡便、準確的基因表達相對關(guān)鍵詞】實時；相對定量；標(biāo)準曲線；基因表達【中圖分類號：文獻標(biāo)識碼：）!（，（，；，）【】（）"（），（""【】；分子流行病學(xué)研究中一個非常重要的內(nèi)容，就是在群體研究基礎(chǔ)上，從分子或基因水平探索疾病的病因和發(fā)病機理。目前，實時已成為基因表達定量的強有力的工具，具有高敏感、重復(fù)性好及定量范圍廣的特點，特別是定量低豐度的及揭示微小的基因表達變化。由于其操作簡單而被廣泛應(yīng)用，但傳統(tǒng)的（!）法定量誤差大

3、。本文介紹了一種簡便、準確的基因表達相對定量實時方法包括標(biāo)準曲線的制作及實驗數(shù)據(jù)的處理?；痦椖浚荷钲谑锌萍加媱濏椖浚ǎＷ髡吆喗椋衡桌伲ǎ?，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事生物化學(xué)與分子毒理學(xué)研究。材料與方法材料采用的細胞株為永生化人支氣管上皮細胞株（）。通訊作者：程錦泉，博士，主任醫(yī)師，：熱帶醫(yī)學(xué)雜志年月第卷第期、轉(zhuǎn)化的及肺癌細胞和純品由廣州醫(yī)學(xué)院化學(xué)致癌研究所紀衛(wèi)東博士贈送。方法細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)個樣本設(shè)個復(fù)孔，同時設(shè)置無模板對照（）。以基因作為內(nèi)參照，進行基因表達相對定量。儀器軟件（公司產(chǎn)品）自動分析給出基因相對表達量）（）或表達比值（）。細胞用含小牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。誘導(dǎo)：儲存液（溶解）用

4、含小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成終濃度分別為、的溶液。待細胞長至數(shù)據(jù)分析實驗數(shù)據(jù)分別采用下列種方法分析。）法：儀器軟件自動分析給出表達比值，使用（統(tǒng)計軟件進行方差分析；%軟件分析：在相應(yīng)界面輸入標(biāo)準曲線及基因表達相對定量值，軟件分析給出表達比值及統(tǒng)計分析結(jié)果。融合時，棄上清，加入含的培養(yǎng)液，誘導(dǎo)，用洗次，細胞按傳代，待細胞長至融合時，再加誘導(dǎo)，共次，以小牛血清培養(yǎng)液作為對照。結(jié)果標(biāo)準曲線的構(gòu)建以正常為模板，分別采用倍、倍及?？偺崛∈占毎?，用試劑（公司產(chǎn)品），按照試劑盒操作步驟提取總合成以各處理組的總為模板進行逆倍系列稀釋制作和基因標(biāo)準曲線，結(jié)果表明倍系列稀釋呈現(xiàn)較好的線型關(guān)系（）。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用試劑

5、盒（公司）。反應(yīng)緩沖體系含隨機引物（）逆轉(zhuǎn)錄酶（）、酶抑制劑、及基因擴增效率分別為、和，基本一致（圖，圖）。熒光值（）、各及總。于儀（，公司產(chǎn)品），。實時定量基因表達分析探針及引物設(shè)計基因表達分析的引物、探針用軟件（公司產(chǎn)品）設(shè)計（表），由上?；瞪锛夹g(shù)公司合成。表基因表達分析的引物探針序列循環(huán)數(shù)基因引物（）探針（）圖標(biāo)準曲線的擴增曲線值（）：代表，代表基團實時定量采用試劑盒（公司產(chǎn)品）。反應(yīng)緩沖體系含引物各、探針、參考染料及。反應(yīng)在熒光定量儀（公司產(chǎn)品）上進行。反應(yīng)條件：預(yù)變性，再，個循環(huán)。初始模板相對定量值標(biāo)準曲線的制作以正常為模板，圖基因標(biāo)準曲線分別進行、倍比稀釋。如倍系列稀釋：、。分

6、別作和基因標(biāo)準曲線。反應(yīng)體系及條件見，儀器軟件（公司產(chǎn)品）自動分析給出擴增效率（，（）?；蛳鄬Χ糠治觯嶒灁?shù)據(jù)分別采用（法及%軟件分析（表基因表達相對定量分析以不同劑量）法計算為，）。如肺癌基因表達比值采用（）而采用%軟件分析為，可見采用（法分析的誘導(dǎo)的、轉(zhuǎn)化的及肺癌細胞為模板，進行實時定量，參見。每表達比值均比%軟件分析高。表基因相對定量表達比值）法計算的表達比值均比"軟件分較，表明采用（劑量（）表達比值（值）（析高。等指出若目的基因與參考基因的擴增效率相差超過，最好采用"軟件分析。采用實時技術(shù)相對定量基因表達，關(guān)鍵一步就是標(biāo)準曲線的制作，即獲得標(biāo)準曲線的斜率，計算擴

7、增效率。一般儀器說明書建議使用倍稀釋法。本文分別采用了倍、倍及倍系列稀釋制作和基因標(biāo)準曲線，結(jié)果表明倍系列稀釋呈現(xiàn)較好的線型關(guān)系（）。總之，實時技術(shù)與"軟件分析相結(jié)合是一種簡便、準確的基因表達相對定量分析手段。參樣本正常"次誘導(dǎo)（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）肺癌轉(zhuǎn)化討論采用實時技術(shù)進行基因表達分析包括絕對考文獻定量及相對定量法。由于研究者多關(guān)注目的基因的表達變化，即實驗組與對照組目的基因表達比值的變化。相對定量法已成為基因表達分析最常用的手段。目前市面上銷售的熒光定量儀如公司、）公司等多采用的（相對定量法。因其將的擴增效俞順章，陳聲林我國分子流行病學(xué)研究進展中華流

8、行病學(xué)雜志，（）：，（），（）：張馳宇，徐順高，黃新祥一種新穎簡便的熒光實時率設(shè)定為，但實際的擴增效率不可能達到，因此該法計算出的相對定量結(jié)果通常比實際結(jié)果要高。"軟件（）是專門設(shè)計用于實時技術(shù)相對定量基因表達分析。其具有如下優(yōu)勢：擴增效率的修正，表達比值（相對定量方法的建立生物化學(xué)與生物物理進展，（）：江慶瀾，李瑜元，曾崢，等鹽酸二甲雙胍對非酒精性脂肪肝大鼠脂肪組織腫瘤壞死因子基因表達的影響中山大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），（）：目的基因（樣品均數(shù)對照均數(shù)，目的基因）（樣品均數(shù)對照均數(shù)，）的計算包括了目的基因及參考基因的擴增效率，結(jié)果更準）確，并不一定要像（法要求目的基因及參考基因的擴，（）：增效率一致；統(tǒng)計學(xué)分析，采用簡單的統(tǒng)計學(xué)隨機檢驗（），克服了傳