大鼠腦缺血再灌流后HSP70的表達(dá)和bFGF對其影響

1、    大鼠腦缺血再灌流后HSP70的表達(dá)和bFGF對其影響        【摘要】目的研究腦缺血再灌流后熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的意義及外源性堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)對其影響。方法應(yīng)用免疫組化的方法觀察大鼠局灶性腦缺血再灌流后腦組織HSP70的表達(dá)以及在側(cè)腦室注射外源性bFGF對其影響。結(jié)果缺血2小時再灌流0小時即可見HSP70表達(dá)，至24小時達(dá)高峰。bFGF組與生理鹽水組相比于648小時各組可見HSP70表達(dá)增高(P<0.05)。結(jié)論腦缺血誘導(dǎo)HS

2、P70的表達(dá)，外源性bFGF能增加HSP70的表達(dá)?！娟P(guān)鍵詞】熱性休克蛋白70堿性成纖維細(xì)胞生長因子腦缺血再灌流 The expression of HSP70 and the effect of bFGF on it in rats following cerebral ische-mia-reperfusionFang Yuan，Tong Etang，Sun Shenggang（Department of Neurology,Xie He Affiliated Hospital of Tongji Medecal University,Wuhan 430022）【Abstract】Obje

3、ctiveTo study the significance of HSP70 expression and its effect of exogenous bFGF on HSP70 expression in rats after cerebral ischemia-reperfusion.MethodsUsing immunohistochemistry mothod.We observed brain HSP70 expression and the effect of exogenous bFGF injected in lateral ventricle on it after f

4、ocal cerebral ischemia-reperfusion in rats.ResultsHSP70 expression could be observed at 0h reperfusion after 2h ischemia,and it reached peak at 24h. And the expression of HSP70 was elevated at 648h reperfusion in bFGF group as compared with physiological saline group(P<0.05).ConclusionCerebral is

5、chemia could induce HSP70 expression. Exogenous bFGF could enhance the expression of HSP70.【Key words】HSP70bFGFCerebral ischemia-reperfusion熱性休克蛋白70(HSP70)是缺血損傷時敏感而可靠的標(biāo)志,缺血、缺氧及癲癇均可誘導(dǎo)HSP70表達(dá)，HSP70表達(dá)增強(qiáng)對神經(jīng)元有保護(hù)作用。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是一種具有多種生物學(xué)活性的多肽生長因子,其神經(jīng)活性廣泛,能保護(hù)神經(jīng)元,促進(jìn)神經(jīng)生長。實驗表明，bFGF在抗缺血性腦損傷中也發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為將是

6、最具有臨床應(yīng)用價值的一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。本研究通過觀察腦缺血再灌流后HSP70的表達(dá)和bFGF對其影響，探討腦缺血后HSP70表達(dá)的意義和bFGF是否通過誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。1材料與方法1.1實驗動物健康雄性Wistar大鼠，體重250300 g，由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物分組：隨機(jī)分為正常組，假手術(shù)組，缺血再灌流組。缺血再灌流組又分為bFGF和生理鹽水組，并根據(jù)不同時間點(diǎn)分為缺血2小時再灌流0、1、6、12、24、48、72小時組,每組各6只大鼠。1.2方法1.2.1模型制作10水合氯醛麻醉，頸正中切口分離結(jié)扎左側(cè)頸總動脈、頸外動脈及其分支，分離頸內(nèi)動脈，將涂有硅

7、酮直徑0.2 mm尼龍線從頸總動脈分叉處插入頸內(nèi)動脈約18±1.0 mm。再灌流時將栓線抽出約10 mm。1.2.2實驗方法bFGF組在缺血后30分鐘，從右側(cè)側(cè)腦室注射含bFGF(Sigma公司)1.2 g1生理鹽水10 l。生理鹽水組則僅給予10 l生理鹽水。側(cè)腦室注射方法：腦立體定向儀下取前囟后0.8 mm，中線旁1.8 mm，硬膜下3.7 mm為注射點(diǎn)2，10 l微量注射器垂直注射。1.2.3HSP70免疫組化染色 缺血再灌流組于不同時間點(diǎn)，假手術(shù)組于術(shù)后24小時及正常組用10水合氯醛麻醉后仰臥固定，快速開胸暴露心臟，經(jīng)升主動脈插管，先用37生理鹽水150 ml快速洗注，再灌注

8、4 4多聚甲醛(Sigma公司)0.1 molL磷酸緩沖液500 ml,灌注時間為1小時，取腦修塊后置上述灌注液及20蔗糖各24小時。將組織塊在冰凍切片機(jī)上行30 m厚的連續(xù)冠狀切片，0.2Triton X-100、0.03H2O2甲醇處理30分鐘，150牛血清白蛋白371小時。鼠抗HSP70單克隆抗體(1200 Sant Crus 公司)4孵育72小時,兔抗鼠IgG 150、兔抗ABC復(fù)合物150(武漢博士德生物工程公司)37各1小時,以上每步均經(jīng)PBS充分洗滌。DAB 呈色、酒精梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。1.2.4統(tǒng)計方法 采用MPIAS-500真彩色細(xì)胞像分析系統(tǒng)，對切片進(jìn)行像

9、分析。同一組內(nèi)不同時間的比較采用方差分析，兩組之間同一時間點(diǎn)的比較采用t檢驗。2結(jié)果正常及假手術(shù)組未見HSP70表達(dá)。生理鹽水組，缺血再灌流06小時組僅見輕度HSP70表達(dá)，主要在梗死灶周圍，陽性反應(yīng)細(xì)胞呈棕黃色，再灌流12小時表達(dá)明顯增加，24小時達(dá)高峰(P<0.01)。bFGF組與生理鹽水組比較，再灌流6小時，HSP70表達(dá)增強(qiáng)，12小時達(dá)高峰(P<0.01)，并持續(xù)到24小時，見表1。表1缺血再灌流各組大鼠腦缺血側(cè)皮質(zhì)HSP70陽性細(xì)胞數(shù)(±s)分組生理鹽水組bFGF組R0 h70.3±27.9481.3±31.36R1 h81.2±3

10、5.2687.6±33.25R6 h90.5±61.32181.9±54.62*R12 h185.6±67.52*387.3±80.12* R24 h338.1±74.61*352.4±72.26R48 h212.5±56.37*275.7±25.46*R72 h94.2±45.21*113.1±39.92*組內(nèi)全部時間點(diǎn)之間的比較均P<0.01；組內(nèi)各個時間點(diǎn)與前一時間點(diǎn)比較*P<0.05，*P<0.01，與生理鹽水組比較P<0.05，P<0.01 3討

11、論在正常情況下HSP70 mRNA在細(xì)胞中水平較低，HSP70的合成也很少。本實驗中正常組及假手術(shù)組未見HSP70表達(dá)，而在缺血再灌流各組中均可見HSP70表達(dá)，提示腦缺血可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞HSP70表達(dá)。在生理鹽水組，缺血再灌注早期僅見HSP70輕度增高，24小時達(dá)高峰后開始下降，與劉軍等3的報道一致。Takemoto等4的研究則發(fā)現(xiàn)缺血5分鐘再灌流24小時未見明顯HSP70表達(dá)，在缺血15分鐘再灌流至96小時才見HSP70表達(dá)達(dá)高峰。由此可見，HSP70的表達(dá)可能與缺血的嚴(yán)重程度及對缺血性損傷的耐受性有關(guān)。本實驗顯示HSP70表達(dá)主要在梗死灶周圍神經(jīng)元，即缺血半暗帶區(qū)，梗死灶中央未見明顯HSP

12、70表達(dá)。Kinouchi等5的研究表明HSP70 mRNA主要在缺血灶周圍神經(jīng)元產(chǎn)生，梗死灶中心的HSP70 mRNA的表達(dá)量則很少，推測HSP70可能與半影區(qū)神經(jīng)元損傷的可逆性有關(guān)。嚴(yán)重缺血時，梗死灶中央?yún)^(qū)則有大量的HSP70 mRNA表達(dá)，沒有HSP70蛋白的合成，被認(rèn)為是神經(jīng)元產(chǎn)生嚴(yán)重缺血的標(biāo)志并與細(xì)胞損傷有關(guān)。有人曾用HSP70單克隆抗體定位來確定缺血后HSP70表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)在短暫缺血后死亡的海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞中HSP70蓄積甚少，存活的齒狀回顆粒細(xì)胞中有明顯的HSP70積累6，表明HSP70的蓄積具有神經(jīng)保護(hù)作用，證明缺血后HSP70表達(dá)對神經(jīng)元有保護(hù)作用，是細(xì)胞存活的原因之

13、一。近年的研究發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞的HSP70表達(dá)水平較非凋亡細(xì)胞水平低，從而推測HSP70可能抑制細(xì)胞凋亡,對缺血神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用7。本實驗bFGF組與生理鹽水組比可見HSP70的表達(dá)高峰時間前移且持續(xù)時間延長，提示缺血后外源性bFGF能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)。有研究表明短暫缺血2分鐘內(nèi)可使缺血以后再缺血時HSP70 mRNA表達(dá)高峰時間前移，HSP70 mRNA及其蛋白細(xì)胞數(shù)增多，神經(jīng)元未受損，推測HSP70合成增多，對缺血神經(jīng)元有保護(hù)作用8。bFGF是一種具有多種生物學(xué)活性的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在離體實驗中已證實外源性bFGF能增加神經(jīng)元的存活，在體實驗也證實外源性bFGF具有保護(hù)腦免受損傷并能阻止缺

14、血后神經(jīng)元死亡、減小梗死體積的作用3。細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載是缺血性腦損傷的關(guān)鍵因素，bFGF則能通過影響鈣離子結(jié)合蛋白而阻止細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子環(huán)境穩(wěn)定而發(fā)揮抗缺血性損傷的作用9。同時bFGF具有抗NMDA、NO及興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用10。腦缺血后，HSP70對細(xì)胞的保護(hù)作用與鈣離子、自由基及興奮性氨基酸有關(guān)。實驗發(fā)現(xiàn)熱休克反應(yīng)能阻止鈣離子內(nèi)流，保護(hù)細(xì)胞免受鈣離子依賴的興奮性毒性作用，而熱休克反應(yīng)能誘導(dǎo)HSP70表達(dá)11。我們推測bFGF可能通過抑制鈣離子內(nèi)流，誘導(dǎo)HSP70的表達(dá)，也提示缺血后bFGF 一方面發(fā)揮自身的神經(jīng)保護(hù)作用，另一方面也可能通過誘導(dǎo)HSP70的合成而發(fā)揮

15、作用，但bFGF是否有直接促HSP70表達(dá)的作用還待進(jìn)一步研究。相信通過進(jìn)一步的實驗研究, 將為臨床應(yīng)用bFGF治療急性卒中提供新的方法。作者單位：方瑗（430022同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科）童萼塘（430022同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科）孫圣剛（430022同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科）王玉（430022同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科）王耀明（430022同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院神經(jīng)科）參考文獻(xiàn)1，Naodi K,David J,Michael A,et al.Pretremeat with intraventricular basic fibroblast growth fac

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