survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及對多西他賽的增敏作用

1、survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡及對多西他賽的增敏作用         10-11-01 09:07:00     作者：劉超俠 董薇 孔慶兗    編輯：studa20【摘要】  目的 探討生存素(survivin)反義寡核苷酸(antisense oligonucleotide, ASODN)對人胃癌細(xì)胞株SGC7901的凋亡誘導(dǎo)、對多西他賽的化療增敏作用。方法 設(shè)計(jì)合成特異性靶向survivin ASODN。

2、將胃癌細(xì)胞株分為空白對照組(Sham組)、單純脂質(zhì)體對照組(Lip組)、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對照組(Lip-SODN組)、ASODN轉(zhuǎn)染組(Lip-ASODN組)。轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot法檢測各組細(xì)胞survivin表達(dá)情況,流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率,MTT法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞對多西他賽的敏感性。結(jié)果 脂質(zhì)體介導(dǎo)survivin ASODN轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞survivin蛋白表達(dá)明顯下降，細(xì)胞凋亡率明顯高于各對照組(P<0.05)，對多西他賽的IC50值明顯低于各對照組(P<0.05)，細(xì)胞生長抑制率明顯高于各對照組(P<0.05)。結(jié)論 survivin ASO

3、DN轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞能下調(diào)survivin蛋白表達(dá),誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖,增強(qiáng)多西他賽化療敏感性。 【關(guān)鍵詞】  生存素;反義寡核苷酸;胃癌細(xì)胞;凋亡;多西他賽;增敏作用Abstract:Objective To investigate the effects of survivin antisense oligonucleotide (ASODN) on the apoptosis and chemosensitivity to docetaxel of the human gastric carcinoma cell line SGC7901. Methods ASODN

4、targeting survivin was designed and constructed. The cultured gastric carcinoma cells were divided into the sham group, lipofectin group, sense oligonucleotide (SODN) group and antisense oligonucleotide (ASODN) group. After transfection for 48 h, the expression level of survivin in each group was de

5、tected by Western blot; the apoptotic rate (AR) was examined by flow cytometry; and the sensitivity of SGC7901 cells to docetaxel was determined by MTT.Results The expression of survivin in SGC7901 cells was downregulated after transfection with survivin ASODN; The AR of ASODN group was significantl

6、y higher than that of the other groups (P<0.05); IC50 of the transfected cells to docetaxel had a significant difference as compared to other groups (P<0.05), and the inhibitory rate (IR) of ASODN group was significantly higher than that of other groups (P<0.05).Conclusion The ASODN transfe

7、ction of gastric carcinoma cells can downregulate the survivin expression, induce cell apoptosis, inhibit cell proliferation and enhance the cell sensitivity to docetaxel, which may help to reverse drug resistance.Key words： survivin; antisense oligonucleotide; gastric tumor cell; apoptosis; docetax

8、el; chemosensitivity生存素(survivin)屬于凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中的新成員，它可以通過有絲分裂促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。凋亡是化療藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的主要模式，survivin在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡敏感性方面起著核心作用。本實(shí)驗(yàn)采用脂質(zhì)體介導(dǎo)survivin反義寡核苷酸( survivin ASODN )轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞SGC7901，以封閉survivin基因的表達(dá)，觀察其對胃癌細(xì)胞SGC7901的凋亡誘導(dǎo)以及對化療藥物多西他賽的化療增敏作用。1 材料和方法1.1 材料 胃癌細(xì)胞株SGC7901購于

9、中國科學(xué)院細(xì)胞生物研究所。survivin反義寡核苷酸、錯(cuò)配寡核苷酸(與反義寡核苷酸相同堿基組成、不同排列順序)由上海生工生物工程公司合成，兩端3個(gè)堿基經(jīng)硫代修飾以對抗核酸酶的降解;反義寡核苷酸為5-CCC AGC CTT CCA GCT CCT TG-3，錯(cuò)配寡核苷酸為5-GCC ACT CCT CGA CTC TCG TC-3。陽離子脂質(zhì)體Lipofectin購于Invitrogen公司。survivin抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體購于Santa Cruz公司，RPMI 1640 購于Invitriogen公司，小牛血清購于杭州四季青公司，多西他賽購于Aventis Pha

10、rma Dagenham公司。1.2 方法1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞株SGC7901用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37、5%CO2的飽和濕度條件下培養(yǎng)。1.2.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的SGC7901，傳代接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，調(diào)整細(xì)胞密度，使每孔的細(xì)胞數(shù)為3×105，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察，約80%細(xì)胞融合時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。設(shè)置空白對照組(Sham組)、單純脂質(zhì)體對照組(Lip組)、正義寡核苷酸轉(zhuǎn)染對照組(Lip-SODN組)和反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染組(Lip-ASODN組)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染12、24、48

11、 h后收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。1.2.3 Western blot法檢測細(xì)胞survivin蛋白表達(dá) 將預(yù)冷至4的勻漿緩沖液加入到經(jīng)HBSS漂洗的培養(yǎng)細(xì)胞中,冰上刮取細(xì)胞，收集，冰浴中超聲破碎(10 s×3)，測定蛋白濃度,以100 g/孔上樣,15% SDS-PAGE凝膠電泳分離,通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。將硝酸纖維素膜置封閉液中室溫孵育3 h后,加入一抗(兔抗人生存素抗體,工作濃度為1500)4孵育過夜,TBST充分漂洗(5 min×3次),加入HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔IgG-AP,工作濃度為1500)37作用2 h,TBST充分漂

12、洗(5 min×3次),以NBT/BCIP顯色,觀察結(jié)果。1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 將收獲的各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,加入預(yù)冷的70%冰乙醇,-20內(nèi)固定24 h,加RNA酶(終濃度為50 mg/L)37反應(yīng)1 h，再加入碘化丙啶溶液(質(zhì)量濃度100 mg/L)避光染色30 min后，在流式細(xì)胞儀上檢測,應(yīng)用相應(yīng)程序軟件進(jìn)行資料的處理和分析。1.2.5 MTT 法檢測各組細(xì)胞對多西他賽的敏感性 收獲的各組細(xì)胞用含10%小牛血清的RPMI 1640重懸,倒置顯微鏡計(jì)數(shù)細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/L,并接種于96孔板內(nèi),每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔，其中1孔作調(diào)零用(空白對照

13、組)，另6孔依次加入0、1、10、20、50、100 g/L的多西他賽，再各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。常規(guī)條件下培養(yǎng)48 h,每孔加入5 g/L的MTT 20 l,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,傾盡上清。每孔加入二甲基亞砜0.1 ml,搖床上搖動約15 min以充分溶解,用酶標(biāo)儀在波長570 nm處檢測各孔光密度值(D值),計(jì)算細(xì)胞生長抑制率(IR)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均D值)/空白對照組平均D值×100%。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，應(yīng)用方差分析、q檢驗(yàn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié) 果2.1 ASODN轉(zhuǎn)染后SGC7901細(xì)胞survivin蛋白表

14、達(dá)變化 ASODN轉(zhuǎn)染組survivin蛋白表達(dá)下調(diào),與各對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);各對照組survivin蛋白表達(dá)無明顯改變，各對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。與其他組比較：#P<0.052.2 ASODN轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡率的影響 ASODN轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)SGC7901細(xì)胞凋亡, ASODN作用48 h的胃癌細(xì)胞，在G1期前出現(xiàn)亞二倍體凋亡峰，對照組未見凋亡峰。ASODN轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯高于其他組(P<0.05),而各對照組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖2。2.3 ASODN轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞對多西他賽敏感性的檢測 各組細(xì)胞隨多西他賽藥物濃度提高，細(xì)胞生長抑制率均呈上升趨勢，但ASODN轉(zhuǎn)染的SGC7901細(xì)胞生長抑制率明顯高于其他各對照組(P<0.05)，Sham、Lip 和 Lip-SODN 對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P&