增齡對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的影響

1、增齡對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的影響                         作者：杜斌 邱麗穎 李英 范紅斌 程建青【摘要】 目的 觀察增齡對大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷(CI/RI)的影響。方法 應(yīng)用線栓的方法，對10、16周齡的雄性SD大鼠作局部腦缺血2 h、再灌24 h模型,觀察增齡對大鼠神經(jīng)癥狀缺失評分、腦損傷面積、病理形態(tài)、腦組織乳酸

2、(LD)、乳酸脫氫酶(LDH)及血清中LDH和肌酸激酶(CK)的影響。結(jié)果 CI/RI 24 h, 兩個年齡組神經(jīng)癥狀缺失評分及腦損傷面積明顯增大，病理形態(tài)改變嚴(yán)重、腦組織LD及LDH明顯下降，血清中LDH和CK明顯升高，以16周齡更為嚴(yán)重。結(jié)論 CI/RI隨年齡增長損傷程度增加，可能與腦的老齡化相關(guān)。 【關(guān)鍵詞】 增齡;腦缺血/再灌注損傷;大鼠腦缺血/再灌注損傷(CI/RI)導(dǎo)致的急性腦損傷，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和功能恢復(fù)。對于這個復(fù)雜多環(huán)節(jié)病理過程，其病情的發(fā)展和轉(zhuǎn)歸尚不明確。本文旨在通過研究不同年齡組大鼠局灶性CI/RI時腦損傷的改變，了解年齡對CI/RI的影響。1 材料與方法1.1 藥品

3、和試劑 氯化三苯基四氮唑(TTC)(上?；瘜W(xué)試劑公司),磷酸鹽緩沖液配制,避光低溫貯存;生化試劑盒(購自南京建成生物工程研究所);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2 實驗動物與分組 雄性SD大鼠，由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供，動物編號為SCXK(滬)20070005。其中10周齡大鼠體重(190±20)g;16周齡大鼠體重(260±20)g。不同年齡組大鼠分別分為假手術(shù)組、CI/RI模型組。術(shù)前12 h禁食,自由飲水。1.3 模型制備 用直徑0.205 mm尼龍線作栓子,參照Longa 等1腔內(nèi)線栓法制作右側(cè)大腦中動脈栓塞(MCAO) 模型。局部腦缺血2 h、拔出線栓行再灌

4、24 h。1.4 神經(jīng)癥狀缺失評分 按5分制評分標(biāo)準(zhǔn)，術(shù)后評13分者為手術(shù)成功標(biāo)志;0分：無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀;1分：不能完全伸展左前肢;2分：向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分行走時向左側(cè)傾斜;4分：不能自行行走。1.5 腦損傷范圍測定 再灌24 h時迅速斷頭取腦，4刀5分法沿冠狀切面切片，2% TTC染色后，正常組織呈紅色，損傷組織呈白色。CAD計算機(jī)軟件計算損傷面積，以占雙側(cè)大腦半球面積的百分比作為損傷面積2。1.6 病理形態(tài)改變 取視交叉至漏斗柄的腦冠狀切片，置10%福爾馬林中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，5 m腦組織冠狀切片作HE染色，觀察腦形態(tài)學(xué)變化。1.7 腦組織LD、LDH的活性測定 取

5、腦組織與生理鹽水制成10%組織勻獎，3 500 r/min離心10 min。取上清于-20保存?zhèn)溆?。LD及LDH的測定嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。1.8 血清LDH、CK的活性測定 再灌24 h時迅速斷頭取血，分離血清樣本,LDH、CK的測定嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)以x±s表示,組間差異用t檢驗。2 結(jié) 果2.1 各組大鼠神經(jīng)癥狀缺失評分 與假手術(shù)組比較，10周齡CI/RI組與16周齡CI/RI組的大鼠均表現(xiàn)不同程度的神經(jīng)癥狀缺失(P<0.01)。與10周齡CI/RI組比較，16周齡CI/RI組神經(jīng)癥狀缺失明顯嚴(yán)重(P<0.01)，見表1。表1 CI/

6、RI時神經(jīng)癥狀缺失評分、腦損傷面積的變化1)與同周齡假手術(shù)組比較，2)與10周齡CI/RI組比較：P<0.01，下表同2.2 各組大鼠腦損傷范圍變化 與10周齡CI/RI組比較，16周齡CI/RI組腦損傷面積擴(kuò)大(P<0.01)，(見表 1，圖 1)。2.3 各組大鼠病理形態(tài)學(xué)的改變 假手術(shù)組，皮層神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，分布均勻，層次清楚，大小一致，胞膜完整，胞漿均勻，核膜清楚，染色質(zhì)顆粒細(xì)小均勻，有一小核仁。10周齡CI/RI組，大腦皮質(zhì)部分細(xì)胞消失，數(shù)目減少，排列紊亂，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，胞核深染，形態(tài)大小不一，血管周圍出現(xiàn)空暈，間質(zhì)疏松。16周齡CI/RI組，大腦皮質(zhì)部分細(xì)胞消失，

7、數(shù)目減少，排列紊亂，細(xì)胞體積大小不一，形態(tài)不規(guī)則，有呈三角形、菱形和不規(guī)則形，胞核深染，大小形態(tài)不一，核膜不清，核仁不明顯。中心區(qū)域出現(xiàn)壞死;星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，膠質(zhì)結(jié)節(jié)形成，血管擴(kuò)張充血，其周圍出現(xiàn)空暈，間質(zhì)疏松，呈網(wǎng)狀改變等。見圖2。                             2.4 各組大鼠腦組織LD

8、、LDH含量變化 與同周齡假手術(shù)組比較，10周齡CI/RI組LD、LDH水平顯著降低(P<0.01)，16 周齡CI/RI組LD、LDH水平顯著低于10周齡CI/RI組(P<0.01)(表2)。2.5 各組大鼠血清CK、LDH含量的變化 與同周齡假手術(shù)組比較，CI/RI組CK、LDH含量顯著升高(P<0.01)。16周齡CI/RI組血清中的CK、LDH含量明顯高于10周齡CI/RI組(P<0. 01)(表3)。表2 CIRI時大鼠腦組織中LD、LDH的變化表3 CIRI時大鼠血清中CK、LDH含量的變化(x±s)3 討 論大量研究表明，CI/RI主要與氧化應(yīng)激

9、反應(yīng)3、能量代謝障礙4、炎癥反應(yīng)5、興奮性氨基酸釋放6、細(xì)胞凋亡7及突觸傳遞受阻8等有關(guān)。實驗研究證實，能量代謝障礙4、興奮性氨基酸釋放9、過氧化反應(yīng)3、炎癥反應(yīng)5及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷10發(fā)生在再灌注520 min內(nèi)， 30 min后有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)7，突觸前蛋白磷酸化受損可持續(xù)至24 h，而其磷酸化免疫反應(yīng)卻在72 h后加強(qiáng)8。血液中胞漿酶含量的變化可準(zhǔn)確地反映腦組織細(xì)胞受損的程度11。本實驗表明,大鼠局灶性腦缺血再灌注后,血清胞漿酶水平增高,組織受損程度加重。在氧自由基及腦細(xì)胞毒性細(xì)胞因子反復(fù)侵襲下,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞,細(xì)胞膜通透性增加,胞漿酶釋放,組織損傷加重。LDH 是標(biāo)志腦血管疾病時腦組

10、織損害最敏感的酶,在缺血性腦損傷組織,各種氧依賴酶的活性也隨之發(fā)生變化,LDH 大量存在于神經(jīng)元細(xì)胞的胞漿和線粒體中,當(dāng)腦缺血引起細(xì)胞損傷后,這些酶即可釋放到細(xì)胞間隙,再擴(kuò)散入腦脊液,通過受損的血腦屏障進(jìn)入血液12。Tagliari等13認(rèn)為, LDH自損傷的細(xì)胞內(nèi)溢出,可通過測量LDH的變化來定量分析腦細(xì)胞損傷的程度。FernándezLópez等14利用分光光度法測定的LDH值,來估計神經(jīng)細(xì)胞的損傷程度。機(jī)體在病理狀態(tài)下, LDH活性增強(qiáng), 催化乳酸脫氫, 此是機(jī)體自動調(diào)節(jié)的保護(hù)性代償機(jī)制。因此可根據(jù)LDH 的活性值的變化判定是否存在梗死灶的不斷擴(kuò)大,梗死是否進(jìn)行性加重

11、。CK是一種細(xì)胞內(nèi)酶,主要分布在骨骼肌,其次為腦組織和心肌。血清CK一樣可以作為顱內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞損害的特異性生化指標(biāo)和分子標(biāo)志,可作為評價腦血管疾病病情和預(yù)后的可靠指標(biāo)并提供臨床治療依據(jù)12。本實驗結(jié)果表明，10周齡CI/RI組血清中CK、LDH較16周齡CI/RI組低。腦組織LDH抑制程度和乳酸下降程度10周齡CI/RI組較輕，表明抗損傷程度較輕。本實驗研究顯示,CI/RI可使血清血CK、LDH含量升高,這與以上研究結(jié)果基本一致。綜上所述，CI/RI時，10周齡組比16周齡組大鼠腦損傷程度較輕，表明與年齡增長有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Longa EZ, Weinstein PR, Carlson

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