黃豆芽微核實驗報告

1、生態(tài)工程學(xué)院遺傳學(xué)設(shè)計性實驗報告題 目： 黃豆根尖微核技術(shù)系 別： 生態(tài)工程學(xué)院專業(yè)班級： 生物科學(xué)2012級組員姓名： 孟 迎、羅廷、何忠平 蔡國憲、丁琴 姓 名： 羅 廷學(xué) 號： 28111201029指導(dǎo)教師： 蹇 黎完成時間： 2015 年 6月11日黃豆根尖微核實驗報告一、實驗?zāi)康?、了解環(huán)境誘變物對微核產(chǎn)生的原理。2、掌握微核試驗技術(shù)。3、了解毒理遺傳學(xué)在環(huán)境監(jiān)測中的應(yīng)用及意義二、實驗原理微核簡稱(MCN)，是真核生物細(xì)胞中的一種異常結(jié)構(gòu)，往往是細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用而產(chǎn)生。微核是無著絲點的染色體斷片，在有絲分裂后期由于不能向兩極移動而游離于細(xì)胞質(zhì)中，在間期細(xì)胞核形成時，可在它

2、附近看到若干個圓形的結(jié)構(gòu)，游離于主核之外直徑大約是細(xì)胞直徑的1/20到1/5，這就是微核。微核的折光率及細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)和主核一樣。一般認(rèn)為微核是由有絲分裂后期喪失著絲粒的斷片產(chǎn)生的，但有些實驗也證明整條的染色體或多條染色體也能形成微核。這些斷片或染色體在細(xì)胞分裂末期被兩個子細(xì)胞核所排斥便形成了第三個核塊。已經(jīng)證實微核率的大小是和用藥的劑量或輻射累積效應(yīng)呈正相關(guān)，這一點和染色體畸變的情況一樣。所以可用簡易的間期微核計數(shù)來代替繁雜的中期畸變?nèi)旧w計數(shù)。由于大量新的化合物的合成，原子能應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排出，使人們需要有一套高度靈敏、技術(shù)簡單的測試系統(tǒng)來監(jiān)視環(huán)境的變化。微核產(chǎn)生的概率可與誘變

3、因子的劑量成正比，因此可以用微核出現(xiàn)的頻率來評價環(huán)境誘變因子對生物遺傳物質(zhì)的損傷程度。目前微核測試已經(jīng)廣泛應(yīng)用于輻射損傷、輻射防護(hù)、化學(xué)誘變劑、新藥試驗、染色體遺傳疾病及癌癥前期診斷等各方面。 隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展、經(jīng)濟(jì)總量增加，廢水排放總量增長迅速，污染物排放總量超過水環(huán)境容量，尤其在一些人口密集、企業(yè)密布或重污染企業(yè)分布較多的區(qū)域。水質(zhì)惡化問題已經(jīng)比較突出；飲用水水源地有機(jī)污染日漸嚴(yán)重，飲用水安全問題已經(jīng)顯現(xiàn)，人民群眾生產(chǎn)、生活受到影響。利用畢節(jié)市流倉河道河水以黃豆萌發(fā)的芽作為實驗材料進(jìn)行微核測試，一方面可準(zhǔn)確的顯示各種處理誘發(fā)植物畸變的效果，另一方面可用于當(dāng)今發(fā)展地區(qū)對河道污染程度的間接反應(yīng)和監(jiān)

4、測。三、實驗器具、藥品1、實驗材料黃豆種子（貴州工程應(yīng)用技術(shù)學(xué)院生態(tài)工程學(xué)院實驗中心供給）2、實驗器材光學(xué)顯微鏡、試管（10ml）、燒杯、鑷子、手術(shù)刀、載玻片、蓋玻片、濾紙等。3、試劑1）NaN3(疊氮鈉) 2）卡諾氏固定液（乙醇和冰醋酸按照體積比3：1混合配制）3）卡寶染色液（Carbol fuchsin）又稱改良石炭酸品紅，改良苯酚品紅。種類成分、配置方法保存時間A液取3g堿性品紅溶于 100mL 的 70%乙醇中長期保存B液取A液10mL，加入 90mL 的 5%石炭酸（又稱苯酚）水溶液限2周內(nèi) C液取B液 55mL，加乙酸和福爾馬林（37甲醛水溶液）各6mL染色液取原液C 2030mL

5、，加 45%的乙酸7080mL，再加山梨醇1.8g4）6mol/L鹽酸：配制：取49.5ml 37.5%的鹽酸，再加入50.5ml水稀釋至100ml容量瓶.四、實驗步驟1、種子處理：黃豆種子洗滌干凈，室溫（25）下用蒸餾水浸泡發(fā)芽24小時，此間至少換水兩次，所換水應(yīng)預(yù)溫至25。種子吸漲后，移入鋪有干凈紗布的托盤內(nèi)，在25溫箱中催芽培養(yǎng)（4-5天），當(dāng)初生根長到2cm時，選取發(fā)育良好的，大小與根長相似的芽，進(jìn)行進(jìn)一步實驗。2、 檢測液采集與處理采集流倉橋不同河段河水，沿河道周邊從夢溪灣到泰豐源，從泰豐源至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院，從碧陽湖至畢節(jié)師專大橋，這三個河段可的上、中、下游三個不同位置的河水混合。瞬時

6、采樣嗎，采集三個樣本，每份兩升以上，水樣暫存于礦泉水瓶或水壺，并做好標(biāo)記。3、實驗處理每一處理選取6-8粒生長良好、芽長一致的種子，放入盛有待測物溶液的培養(yǎng)皿中，浸沒發(fā)芽種子。用被檢測液處理種子，用蒸餾水作陰性對照，處理種子624h（處理時間可視實驗需要和被測液濃度而定）。4、根尖細(xì)胞恢復(fù)培養(yǎng)將處理后的種子用蒸餾水浸洗三次，每次2-3min。將洗凈的種子再放入鋪好濾紙的托盤內(nèi)25溫箱中恢復(fù)培養(yǎng)22-24小時。5、固定：吸取5ml的卡諾氏固定液于10ml試管中，用刀片或小剪刀切取經(jīng)過處理的長約的黃豆芽10-20條，放入試管內(nèi)，用試管塞蓋緊，室溫下固定20-24小時，固定液的用量為材料體積的15倍

7、以上。固定后如果不及時制片，可換入70% 的乙醇中，置4冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?、酸解：取出固定好的黃豆芽，用蒸餾水沖洗min，洗凈蒸餾水，加入6mol/L鹽酸將芽浸沒，室溫下酸解10分鐘，待芽軟化即可。7、染色：解離后材料水洗3min并吸干，挑取1個芽的尖部分生組織于載玻片上夾碎搗爛，滴加12滴改良苯酚品紅染液，染色1015min，壓片。8、壓片 在經(jīng)染色的材料上加一滴染液，蓋上蓋玻片，覆一層吸水紙，用帶橡皮頭的鉛筆垂直敲打，或以拇指垂直緊壓蓋片(注意勿使蓋片搓動)，使材料分散壓平，便于觀察。9、鏡檢及微核識別標(biāo)準(zhǔn)首先在低倍鏡下找到分生組織區(qū)細(xì)胞分散均勻，分裂相較多的部位，再轉(zhuǎn)高倍鏡觀察。微核識別

8、標(biāo)準(zhǔn)：（1）在主核大小的1/3以下，并與主核分離的小核。（2）小核著色與主核相當(dāng)或稍淺。（3）小核形態(tài)為圓形、橢圓形或不規(guī)則型。每一處理觀察3個根尖，每個根尖計數(shù)1000個細(xì)胞中的微核數(shù)并進(jìn)行記錄。10、微核率及微核指數(shù)計算（1）計算微核率（）：（2）計算微核指數(shù)（MI）：用微核指數(shù)作為判斷實驗樣本是否致黃豆芽細(xì)胞突變的指標(biāo)，以直觀反映實驗材料是否致突變及其嚴(yán)重程度。污染指數(shù)在01.5區(qū)間為基本沒有污染；1.52區(qū)間為輕污染；23.5區(qū)間為中污染；3.5以上為重污染，將樣本的黃豆芽微核指數(shù)大于1.5 定為開始產(chǎn)生致突變作用。五、實驗結(jié)果1、實驗進(jìn)程記錄（包括預(yù)實驗）1）實驗進(jìn)程及處理（1）從碧

9、陽湖至畢節(jié)學(xué)院河段河水處理種子前后發(fā)芽情況（處理1）從以下記錄可知：種子用檢測液處理后種子芽生長伸長，且芽的直徑變得膨大。但種子及芽的顏色有一定的變黑，甚至有的種子出現(xiàn)了潰爛。從碧陽湖至畢節(jié)學(xué)院河段河水處理前 從碧陽湖至畢節(jié)學(xué)院河段河水處理后（2）從泰豐源至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院河段河水處理前后發(fā)芽情況（處理2）從以下記錄可知：種子用檢測液處理后種子芽也生長伸長了，芽的直徑也變得膨大，種子及芽的顏色也有一定的變黑，也有種子潰爛。但是其芽顏色變黑程度較上述實驗（1）的淺，其潰爛種子數(shù)量也較實驗（1）的少。從泰豐源至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院河段河水處理前 從泰豐源至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院河段河水處理后（3） 從夢溪灣至畢節(jié)技術(shù)學(xué)

10、院河段河水處理前后發(fā)芽情況（處理3）從以下記錄可知：和上述實驗結(jié)果相似，種子用檢測液處理后種子芽也生長伸長了，且芽的直徑變得膨大，種子及芽的顏色也有一定的變黑，也有種子潰爛。但是相對實驗（2）的實驗結(jié)果而言，其芽顏色變黑程度不及實驗（2）的變化明顯，其潰爛種子數(shù)量也較實驗（2）的還少。從夢溪灣至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院河段河水處理前 從夢溪灣至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院河段河水處理后（4） 蒸餾水陰性對照處理前后發(fā)芽情況（陰性對照）從以下記錄可知：種子有蒸餾水處理前后種子，種子的芽僅僅只有伸長生長，沒有出現(xiàn)直徑的增粗膨大，也沒有出現(xiàn)芽的變色和根的潰爛等現(xiàn)象。 蒸餾水陰性對照處理前 蒸餾水陰性對照處理后2） 鏡檢下微核的

11、識別及微核數(shù)的記錄在4010的高倍鏡下可見：在間期細(xì)胞的細(xì)胞核的附近有若干個圓形的結(jié)構(gòu)，直徑大約是細(xì)胞直徑的1/20到1/5的結(jié)構(gòu)，這就是微核。還可見在分裂期的細(xì)胞前期、中期和后期的細(xì)胞內(nèi)有為數(shù)不多的染色體，且在染色體周圍分布有許多橢圓形的微核，而在分裂末期的細(xì)胞中可見除了少數(shù)不多的染色體被平均分配到兩個子細(xì)胞內(nèi)外，微核并沒有被分到兩個子細(xì)胞內(nèi)，而是一個子細(xì)胞有許多的微核，而另一個細(xì)胞僅僅幾個微核甚至沒有。 不同河水處理黃豆芽在顯微鏡下的微核數(shù)記錄陰性對照處理1處理2處理3微核數(shù)31116348微核率（）0.13.72.11.6微核指數(shù) MI3.72.12.1六、實驗分析1、注意事項（1）固定

12、材料如果不能及時使用：可以經(jīng)過90酒精換到70酒精中各半小時，換入70酒精，0-4攝氏度保存半年，再觀察時換用固定液再處理一次，效果較好。（2）化學(xué)藥品處理濃度太高，會導(dǎo)致細(xì)胞核變形，而不是形成微核，故應(yīng)該多設(shè)濃度梯度或進(jìn)行預(yù)實驗。2、實驗結(jié)果分析與討論從碧陽湖至畢節(jié)學(xué)院河段河水處理種子（處理1）微核率和微核指數(shù)最大，其河道被污染從，泰豐源至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院河段河水處理種子（處理2）的微核率和微核指數(shù)比從夢溪灣至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院河段河水處理種子（處理3）的大從所采集的三個不同河段其周圍的聚集人口的密集程度來說，從碧陽湖至畢節(jié)學(xué)院河段所處畢節(jié)市城區(qū)位置，加上碧陽湖水庫的建立以及周邊較多建筑工業(yè)的實施，使得該區(qū)域段人口相對較為密集，污染程度相對較大，所以該河段的微核率及微核指數(shù)較大。而從泰豐源至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院與從夢溪灣至畢節(jié)技術(shù)學(xué)院這兩個河段由于離公路有一定的距離加上其上游從夢溪灣上去基本上很少有人的過往，