生物信息學(xué)在基因芯片中的應(yīng)用ppt課件

1、第八章第八章 生物信息學(xué)在基因芯片生物信息學(xué)在基因芯片中的運(yùn)用中的運(yùn)用主講人：孫 嘯劉志華東南大學(xué) 吳健雄實(shí)驗(yàn)室 生物信息學(xué)和基因芯片是生命科學(xué)研討領(lǐng)域中的兩種新方法和新技術(shù)，生物信息學(xué)與基因芯片親密相關(guān)，生物信息學(xué)促進(jìn)了基因芯片的研討與運(yùn)用，而基因芯片那么豐富了生物信息學(xué)的研討內(nèi)容 第一節(jié) 概述、基因芯片簡介基因芯片的根本原理及生物信息學(xué)的作用 基因芯片gene chip，又稱DNA微陣列microarray，是由大量DNA或寡核苷酸探針密集陳列所構(gòu)成的探針陣列，其任務(wù)的根本原理是經(jīng)過雜交檢測信息。 基因芯片把大量知序列探針集成在同一個基片上，經(jīng)過標(biāo)志的假設(shè)干靶核酸序列經(jīng)過與芯片特定位置上的

2、探針雜交,便可根據(jù)堿基互補(bǔ)匹配的原理確定靶基因的序列。 根據(jù)探針的類型和長度，基因芯片可分為兩類。 其中一類是較長的DNA探針100mer芯片 這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，經(jīng)過點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA的表達(dá)分析。 另一類是短的寡核苷酸探針芯片 其探針長度為25 mer左右，普統(tǒng)統(tǒng)過在片原位合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。原理原理 - - 經(jīng)過雜交檢測信息經(jīng)過雜交檢測信息一組寡核苷酸探針TATGCAATCTAGCGTTAGATACGTTAGAATACGTTAGATCTACGTTAG由雜交位置確定的一組核酸探針序列GTTAGATC雜交

3、探針組TATGCAATCTAG重組的互補(bǔ)序列靶序列TACGTTAGACGTTAGAATACGTTACGTTAGATGTTAGATC ATACGTTA基因芯片熒光標(biāo)志的樣品 共聚焦顯微鏡獲取熒光圖象雜交結(jié)果分析探 針 設(shè) 計(jì)雜交基因芯片制備 基因芯片的制備主要有兩種根本方法: 一是在片合成法， 在片合成法是基于組合化學(xué)的合成原理,它經(jīng)過一組定位模板來決議基片外表上不同化學(xué)單體的偶聯(lián)位點(diǎn)和次序。在片合成法制備DNA芯片的關(guān)鍵是高空間分辨率的模板定位技術(shù)和固相合成化學(xué)技術(shù)的精巧結(jié)合。 另一種方法是點(diǎn)樣法。 基因芯片點(diǎn)樣法首先按常規(guī)方法制備cDNA或寡核苷酸探針庫，然后經(jīng)過特殊的針頭和微噴頭, 分別把

4、不同的探針溶液，逐點(diǎn)分配在玻璃、尼龍或者其它固相基底外表上不同位點(diǎn),并經(jīng)過物理和化學(xué)的結(jié)合使探針被固定于芯片的相應(yīng)位點(diǎn)。 靶基因樣品的制備及芯片雜交 根據(jù)基因芯片的檢測目的不同,可以把樣品制備方法分為 用于表達(dá)譜丈量的mRNA樣品制備 用于多態(tài)性(或突變)研討的基因樣品的制備雜交信號檢測 對于用熒光素標(biāo)志經(jīng)擴(kuò)增也可用其他放大技術(shù)的序列或樣品，與芯片上的探針進(jìn)展雜交，然后沖洗，采集熒光圖像。 圖像的采集用落射熒光顯微鏡 或電荷偶聯(lián)安裝照相機(jī) 非共聚焦激光掃描儀等進(jìn)展。 、基因芯片對于生物分子信息檢測的作用和意義 在生命科學(xué)領(lǐng)域中，基因芯片為分子生物學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等研討提供了強(qiáng)有力的手段。 利用基因

5、芯片技術(shù)，可研討生命體系中不同部位、不同生長發(fā)育階段的基因表達(dá)，比較不同個體或物種之間的基因表達(dá)，比較正常和疾病形狀下基因及其表達(dá)的差別。 基因芯片技術(shù)也有助于研討不同層次的多基因協(xié)同作用的生命過程，發(fā)現(xiàn)新的基因功能，研討生物體在進(jìn)化、發(fā)育、遺傳過程中的規(guī)律。、基因芯片研討和運(yùn)用中所涉及到的生物信息學(xué)問題提取什么信息提取什么信息如何提取信息如何提取信息如何處置和利用信息如何處置和利用信息確定芯片檢測目的確定芯片檢測目的芯片設(shè)計(jì)芯片設(shè)計(jì)數(shù)據(jù)管理與分析數(shù)據(jù)管理與分析探針設(shè)計(jì)探針設(shè)計(jì)處理雜交條件處理雜交條件一致性問題一致性問題芯片優(yōu)化芯片優(yōu)化提高芯片制備提高芯片制備效率效率公共公共 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫公用

6、公用 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫確定目的確定目的選擇待檢測選擇待檢測的目的序列的目的序列數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析分析雜交檢測分析雜交檢測結(jié)果及可靠性結(jié)果及可靠性基因芯片基因芯片 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫圖像處置圖像處置數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 庫庫 查查 詢詢 序序 列列 分分 析析生生 物物 信信 息息 學(xué)學(xué) 數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 挖挖 掘掘 數(shù)數(shù) 據(jù)據(jù) 可可 視視 化化雜交雜交檢測檢測圖像圖像基因芯片數(shù)據(jù)流圖基因芯片數(shù)據(jù)流圖生物信息學(xué)在基因芯片中的運(yùn)用 生物信息學(xué)在基因芯片中的運(yùn)用主要表達(dá)在三個方面: 確定芯片檢測目的 芯片設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理與分析基因芯片研討與運(yùn)用中所要處理的信息學(xué)問題 在基因芯片信息學(xué)方面要處理以下幾個關(guān)鍵的問題: 第一是芯片

7、設(shè)計(jì)問題 第二是可靠性分析問題 第三是數(shù)據(jù)發(fā)掘問題 第二節(jié)第二節(jié) 基因芯片設(shè)計(jì)基因芯片設(shè)計(jì)、基因芯片設(shè)計(jì)的普通性原那么基因芯片設(shè)計(jì)主要包括兩個方面:(1)探針的設(shè)計(jì)指如何選擇芯片上的探針(2)探針在芯片上的規(guī)劃指如何將探針排布在芯片上。 確定芯片所要檢測的目的對象確定芯片所要檢測的目的對象 查詢生物分子數(shù)據(jù)庫查詢生物分子數(shù)據(jù)庫 獲得相應(yīng)的獲得相應(yīng)的DNADNA序列數(shù)據(jù)序列數(shù)據(jù) 序列對比分析序列對比分析 找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。序列。 數(shù)據(jù)庫搜索數(shù)據(jù)庫搜索 得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。 在進(jìn)展探針設(shè)計(jì)和規(guī)劃時必

8、需思索以下在進(jìn)展探針設(shè)計(jì)和規(guī)劃時必需思索以下幾個方面：幾個方面： (1) (1)互補(bǔ)性互補(bǔ)性 (2) (2)敏感性和特異性敏感性和特異性 (3) (3)容錯性容錯性 (4) (4)可靠性可靠性 (5) (5)可控性可控性 (6) (6)可讀性可讀性 、DNA變異檢測型芯片與基因表達(dá)型芯片的設(shè)計(jì) 對于DNA序列變異分析，最根本的要求是可以檢測出發(fā)生變異的位置，進(jìn)一步的要求是可以發(fā)現(xiàn)發(fā)生了什么樣的變化。 從雜交的單堿基錯配區(qū)分才干來看，當(dāng)錯配出如今探針中心時，區(qū)分才干強(qiáng)，而當(dāng)錯配出如今探針兩端時，區(qū)分才干非常弱。所以，在設(shè)計(jì)檢測DNA序列變異的探針時，檢測變化點(diǎn)應(yīng)該對應(yīng)于探針的中心，以得到最大的分

9、辨率。、cDNAcDNA芯片與寡核苷酸芯芯片與寡核苷酸芯片的設(shè)計(jì)片的設(shè)計(jì) cDNA芯片設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于數(shù)據(jù)庫的建立和數(shù)據(jù)庫信息的利用以及各種文庫的建立。 cDNA芯片制備方法普通采用點(diǎn)樣法，多用于基因表達(dá)的監(jiān)控和分析。 寡核苷酸芯片制備普通采用在片合成方法。優(yōu)化是寡核苷酸芯片設(shè)計(jì)的一個重要環(huán)節(jié)，包括探針的優(yōu)化和整個芯片設(shè)計(jì)結(jié)果的優(yōu)化。 、寡核苷酸探針的優(yōu)化設(shè)計(jì)、基因芯片規(guī)劃雜雜 交交 模模 式式探探 針針 布布 局局 圖圖Target T C C G T T A G C T G A C T G CAGCTTG變異、基因芯片規(guī)劃基于Tm值梯度場的規(guī)劃方法 凸點(diǎn)均勻分布規(guī)劃方法a (b)凸點(diǎn)均勻分布

10、優(yōu)化結(jié)果表示(a)優(yōu)化前； (b)優(yōu)化后。、基因芯片優(yōu)化 高密度寡核苷酸芯片設(shè)計(jì)的結(jié)果是構(gòu)成芯片合成方案和步驟，產(chǎn)生制造掩膜板的CAD文件。高密度基因芯片制備的一個關(guān)鍵是掩膜板技術(shù)，利用掩膜板進(jìn)展定位并控制探針的在片合成，從而得到很高的探針密度。 但是制造掩膜板的代價較高，為了盡能夠地提高基因芯片制備效率，需求對設(shè)計(jì)好的基因芯片進(jìn)展優(yōu)化，以減少制備芯片所需求的掩膜板個數(shù)，同時也減少芯片探針循環(huán)合成次數(shù)，這對于基因芯片運(yùn)用有著重要的意義。第三節(jié)第三節(jié) 基于芯片的序列分析基于芯片的序列分析、測定未知序列 早期基于芯片雜交的序列分析實(shí)驗(yàn)中，芯片上的探針是長度為k普通為8的一切寡核苷酸的組合。這是一種

11、完備的探針集合，根據(jù)互補(bǔ)關(guān)系，經(jīng)過各個探針的雜交結(jié)果確定DNA靶序列中存在的一切k長度片段，構(gòu)成靶序列的k長度片段譜，然后根據(jù)這些片段重構(gòu)靶序列。 、直接檢測目的序列 在同一塊芯片上設(shè)計(jì)多組探針，每一組探針分別檢測一條目的序列，探針的長度在20到30之間。普通要求同一組探針之間相互獨(dú)立，盡能夠不重疊或少重疊，以提高探針的敏感性和特異性。、DNA序列突變檢測分析有兩種方法可以進(jìn)展知突變點(diǎn)的分析:一種方法是對于目的序列上知的突變點(diǎn)，以該點(diǎn)為中心，從目的序列選取一個片段，作為設(shè)計(jì)探針的參考序列。根據(jù)參考序列，分別設(shè)計(jì)四個高度特異的探針，這四個探針除中心位置外均一樣并與參考序列互補(bǔ) 另一種方法是對于目

12、的序列上知的突變點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)四組探針，其中每一組探針分別檢測一種核苷酸交換。同一組中的各個探針長度一樣，相互之間交疊，并且每個探針均覆蓋對應(yīng)的突變點(diǎn)。、基因型和多態(tài)性分析 在同一物種不同種群和個體之間，有著多種不同的基因型，這往往與個體的不同性狀和多種遺傳性疾病有著親密的關(guān)系。經(jīng)過對大量具有不同性狀的個體的基因型進(jìn)展比較，就可以得出基因與性狀的關(guān)系。 為了進(jìn)展SNPs研討，發(fā)現(xiàn)目的序列上能夠出現(xiàn)的變化，最直接的方法就是根據(jù)知的目的序列設(shè)計(jì)一系列寡核苷酸探針，其中每一個探針用于檢測目的序列特定位置上的核苷酸能否發(fā)生變化，探察位置位于探針的中心。這種方法又稱等長等覆蓋移位法 第二種方法為單核苷酸分

13、析法。針對目的序列每個位置上一切能夠出現(xiàn)的變化設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針。 第四節(jié)第四節(jié) 基于芯片的基因功能基于芯片的基因功能分析分析、基因表達(dá)分析基因表達(dá)是根據(jù)基因的DNA模板進(jìn)展mRNA和蛋白質(zhì)合成的過程，各種基因的表達(dá)存在差別，一種組織中基因表達(dá)程度的差別可達(dá)1萬倍。功能基因研討的一種重要的方法就是采用高通量基因表達(dá)檢測技術(shù)，全面分析基因的表達(dá)程度，了解基因的功能。 、高密度基因表達(dá)芯片、基因表達(dá)圖譜 基于芯片的表達(dá)監(jiān)控實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)，在這些數(shù)據(jù)背后隱藏著豐富的基因相互作用、基因功能信息，需求經(jīng)過細(xì)致的數(shù)據(jù)分析提示這些信息，得到有益的結(jié)果 這種根據(jù)基因芯片獲得的新的表達(dá)圖譜有別于以前的物理圖和功

14、能圖，它可以更為直接地提示基因組中各基因相互關(guān)系。、尋覓基因功能 DeRisi等運(yùn)用酵母cDNA基因芯片研討在有絲分裂和孢子形狀下基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)程度的差別。 Affymetrix公司制備的酵母基因表達(dá)型芯片，包括酵母基因組開放讀碼框中的260 000個25mer探針陣列。Wodicka 等采用這種基因芯片對不同生活形狀下酵母細(xì)胞的基因表達(dá)進(jìn)展了研討。 第五節(jié)第五節(jié) 基因芯片檢測結(jié)果的基因芯片檢測結(jié)果的分析分析、熒光檢測圖像處置基因芯片與樣本雜交以后，用圖像掃描儀器捕獲芯片上的熒光圖像。在計(jì)算機(jī)中，一幅圖像由二維象素點(diǎn)所組成，通常用一個8-bit的整數(shù)存貯象素點(diǎn)的灰度值，取值范圍為0,255，其

15、中0代表“黑，255代表“白。 一個理想的基因芯片圖像具有以下幾個性質(zhì)： 1芯片單元的外形和尺寸一樣； 2每個單元的中心位于象素點(diǎn)上； 3無灰塵等引起的噪聲信號； 4最小和均勻的圖像背景強(qiáng)度。 圖象預(yù)處置圖象預(yù)處置網(wǎng)格定位網(wǎng)格定位背景濾除背景濾除熒光信號提取熒光信號提取歸一化處置歸一化處置網(wǎng)格定位結(jié)果1234GT010203040506070GCTA背景區(qū)域背景濾除熒光信號提取、檢測結(jié)果分析 假設(shè)芯片檢測的目的是測定樣本序列，那么需求根據(jù)芯片上每個探針的雜交結(jié)果判別樣本中能否含有對應(yīng)的互補(bǔ)序列片段，并利用生物信息學(xué)中的片段組裝算法銜接各個片段，構(gòu)成更長的目的序列。 假設(shè)芯片檢測的目的是進(jìn)展序列

16、變異分析，那么要根據(jù)全匹配探針以及錯配探針在基因芯片對應(yīng)位置上的熒光信號強(qiáng)度，給出序列變化的位點(diǎn)，并指明發(fā)生什么變化。 假設(shè)芯片檢測的目的是進(jìn)展基因表達(dá)分析，那么需求給出芯片上各個基因的表達(dá)圖譜，定量描畫基因的表達(dá)程度，進(jìn)一步的分析還包括根據(jù)基因表達(dá)方式進(jìn)展聚類，尋覓基因之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)協(xié)同任務(wù)的基因、檢測結(jié)果可靠性分析可靠性分析可以從兩個方面進(jìn)展：一是根據(jù)實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)誤差如探針合成的錯誤率、全匹配探針與錯配探針的誤識率等，計(jì)算出基因芯片最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。二是對基因芯片與樣本序列雜交過程進(jìn)展分子動力學(xué)研討，建立芯片雜交過程的計(jì)算機(jī)仿真實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以便在制造芯片之前分析所設(shè)計(jì)芯片的性能，預(yù)測芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。、數(shù)據(jù)分析 基因芯片數(shù)據(jù)分析包括實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)管理、數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)處置等 進(jìn)一步將基因芯片實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫中的信息相關(guān)聯(lián)，利用數(shù)據(jù)發(fā)掘方法進(jìn)展分析處置，提示各種數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)新的生物學(xué)知識。第六節(jié)第六節(jié) 基因芯片信息的管理基因芯片信息的管理和利用和利用、芯片信息管理目前已出現(xiàn)