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1、第二章 核酸雜交技術(shù)(一)名詞解釋 1原位雜交2核酸分子雜交技術(shù)3探針 4反向點(diǎn)雜交5缺口平移標(biāo)記法6隨機(jī)引物標(biāo)記法7末端標(biāo)記法8Southern blot雜交9熒光原位雜交10菌落雜交(二)選擇題【A型題 】1DNA鏈的Tm值主要取決于核酸分子的( )A GC含量B AT含量C AG含量D AC含量E TG含量2液相雜交是下列哪一種( )A Southem印跡雜交B Northem印跡雜交C Dot印跡雜交D Slot印跡雜交E RPA實(shí)驗(yàn)3研究得最早的核酸分子雜交種類是( )A 菌落雜交B Southern雜交C Northern雜交D 液相雜交E 原位雜交4Southern雜交通常是指(

2、 )A DNA和RNA雜交B DNA和DNA雜交C RNA和RNA雜交D 蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)雜交E DNA和蛋白質(zhì)雜交5最容易降解的核酸探針是( )A cDNA探針B dsDNA探針C ssDNA探針D gDNA探針E: RNA6探針基因芯片技術(shù)的本質(zhì)就是( )A 核酸分子雜交技術(shù)B 蛋白質(zhì)分子雜交技術(shù)C 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)D 基因重組技術(shù)E 酶切技術(shù)7DNA探針的長度通常為( )A 1000 2000個堿基B 500 1000個堿基C 400 500個堿基D 100 400個堿基E. <100個堿基8寡核苷酸探針的最大的優(yōu)勢是( )A 雜化分子穩(wěn)定B 可以區(qū)分僅僅一個堿基差別的靶序列C 易標(biāo)

3、記D 易合成E 易分解9在Southern印跡中常用的核酸變性劑是( )A 甲醛B 乙醛C 氫氧化鈉D 碳酸鈉E 鹽酸10鹽酸硝酸纖維素膜最大的優(yōu)點(diǎn)是( )A 脆性大B 本底低C 共價(jià)鍵結(jié)合D 非共價(jià)鍵結(jié)合E 高結(jié)合力11最常用的DNA探針標(biāo)記方法是( )A 隨機(jī)引物 B 切口平移C 3 -末端標(biāo)記 D 5 -末端標(biāo)記E PCR法12為了除去探針,重復(fù)使用濾膜,以下哪種情況不可以發(fā)生( )A 探針在預(yù)雜交與除去探針之間的過程中曾經(jīng)干燥過B 探針在預(yù)雜交與除去探針之間的過程中曾經(jīng)濕潤過C 探針在預(yù)雜交與除去探針之間的過程中曾經(jīng)溫浴過D 探針在預(yù)雜交與除去探針之間的過程中曾經(jīng)漂洗過E 探針在預(yù)雜交

4、與除去探針之間的過程中曾經(jīng)標(biāo)記過135一末端的DNA探針標(biāo)記主要依靠的酶是( )A T4多聚核苷酸激酶B 末端轉(zhuǎn)移酶C AKP D DNA polE DNA pol14血友病是一種( )A 染色體病B X連鎖遺傳病C 先天性代謝缺陷病D 先天畸形E 常染色體隠性遺傳病15預(yù)雜交中最常用的封閉劑是( )A Denhavdt's溶液 B 5×TBE C 1×TBE D 1×TAE E 1×TPE16檢測目標(biāo)是RNA的技術(shù)是( )A Southern雜交B Western雜交C Northern雜交D Eastern雜交E 雜交淋巴瘤17檢測靶序列是D

5、NA的技術(shù)是( )A Southern雜交B Western雜交C Northern雜交D Eastern雜交E 雜交淋巴瘤18DNA雙螺旋之間氫鍵斷裂,雙螺旋解開,DNA分子成為單鏈,這一過程稱( )A 變性B 復(fù)性C 復(fù)雜性D 雜交E 探針19具有堿基互補(bǔ)區(qū)域的單鏈又可以重新結(jié)合形成雙鏈,這一過程稱( )A 變性B 復(fù)性C 復(fù)雜性D 雜交E 探針20一種標(biāo)記核酸與另一種核酸單鏈進(jìn)行配對形成異源核酸分子的雙鏈,這一過程稱( )A 變性B 復(fù)性C 復(fù)雜性D 雜交E 探針21點(diǎn)/狹縫雜交可以用于( )A 快速確定是否存在目的基因B 不僅可以檢測DNA樣品中是否存在某一特定的基因,而且還可以獲得基

6、因片段的大小及酶切位點(diǎn)分布的信息C 用于基因定位分析D 陽性菌落的篩選E 蛋白水平的檢測22放射自顯影時反射光產(chǎn)生的潛影 在低溫下較穩(wěn)定,最適溫度是( )A -70 B -30C -20 D -10E 423Southern印跡雜交可以用于( )A 不僅可以檢測DNA樣品中是否存在某一特定的基因,而且還可以獲得基因片段的大小及酶切位點(diǎn)分布的信息B 檢測的目標(biāo)是RNAC 用于基因定位分析D 陽性菌落的篩選E 蛋白水平的檢測24寡核苷酸探針的Tm簡單計(jì)算公式為( )A Tm=4(G+C)+2(A+T)B Tm=2(G+C)+4(A+T)C Tm=6(G+C)+4(A+T)D Tm=2(G+C)+6

7、(A+T)E Tm=6(G+C)+2(A+T)25Northern印跡雜交可以用于( )A 快速確定是否存在目的基因B 不僅可以檢測DNA樣品中是否存在某一特定的基因,而且還可以獲得基因片段的大小及酶切位點(diǎn)分布的信息C 檢測的目標(biāo)是RNAD 用于基因定位分析E 陽性菌落的篩選2626熒光原位雜交可以用于( )A 快速確定是否存在目的基因B 檢測的目標(biāo)是RNAC 用于基因定位分析D 陽性菌落的篩選E 蛋白水平的檢測27以等位基因特異的寡核苷酸探針雜交法診斷某常染色體隱性遺傳病時,若能與突變探針及正常探針接合,則該樣本為( ) A 正常人B 雜合體患者C 純合體患者D 攜帶者E 不能確定28在pH

8、為下述何種范圍時,Tm值變化不明顯( ) A pH為35 B pH為45C pH為56 D pH為59E pH為81129一般來說,設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針的長度為( ) A 2-10bpB 17-50bpC 60-100bpD 100-200bpE 200-300bp30變性劑可使核酸的Tm值降低,常用的變性劑是( )A 甲酰胺 B 氫氧化鈉C 濃鹽酸 D 稀鹽酸E 甲醇31下列有關(guān)cDNA探針的描述不正確的為( ) A 利用mRNA通過RT-PCR在體外反轉(zhuǎn)錄可制備大量的cDNA探針B cDNA探針不包含內(nèi)含子C cDNA探針不包含大量的高度重復(fù)序列D 由于cDNA探針自身所攜帶的poly(dT

9、),有可能產(chǎn)生非特異性雜交的問題E cDNA探針合成方便,成為探針的重要來源32一般來說核酸雜交的溫度低于其Tm值的多少度進(jìn)行( )A 1525 B 1015C 510 D 3040E 405033對于寡核苷酸探針,雜交溫度一般般低于其Tm值( )A 3040 B 2030C 1530 D 1015E 534一般情況下,不含變性劑甲酰胺時,雜交反應(yīng)常在多少下進(jìn)行( )A 90 B 80C 75 D 68E 5835在含50%甲酰胺時,雜交反應(yīng)在多少進(jìn)行( )A 70 B 65C 55 D 42E 3536雜交時的溫度與錯配率有關(guān),錯配率每增加1%,則Tm值下降( )A 0.5 B 11.5C

10、22.5 D 33. SE 44.5 37RNA/RNA的雜交體的Tm值一般應(yīng)增加( )A 15 B 510C 1015 D 1520E 202538雜交的時間一般為Cot1/2的( )A l倍 B 13倍C 3 5倍 D 58倍E 10倍以上39為封閉非特異性雜交位點(diǎn),可在預(yù)雜交液中加入( )A ssDNA B 1×SSCC 10×SSC D 5×TBEC E 50×TAE40隨機(jī)引物法標(biāo)記探針常用的A、G、C、T聚合體的數(shù)目是( )A 4個 B 6個C 8個 D 10個E 12個 【X型題】41下列哪些是影響DNA復(fù)性的因素( )A DNA濃度 B

11、DNA的分子量C 溫度 D 堿基組成E DNA的來源42 DNA探針的優(yōu)點(diǎn)有( )A 制備方法簡單B DNA探針易降解C DNA探針的標(biāo)記方法成熟,有多種方法可以選擇D 克隆在質(zhì)粒載體中,可以無限繁殖,取之不盡E 單鏈,不存在競爭性的自身復(fù)性43以下哪些方法可以用于探針的全程標(biāo)記( )A DNA加尾法B DNA切口平移標(biāo)記法C 隨機(jī)引物標(biāo)記法D 末端標(biāo)記E 尾端標(biāo)記44關(guān)于DNA變性的描述正確的是( )A 二級結(jié)構(gòu)破B 一級結(jié)構(gòu)破壞C 黏度降低D 生物活性喪失E 浮力密度增加45以下哪些因素可以使DNA變性( )A 增加溶液的濃度B 加熱C 改變?nèi)芤旱膒H值D 有機(jī)溶劑E 冷藏46預(yù)雜交中,下

12、列能起封閉作用的是( )A ssDNA B BSA C 小牛胸腺DNA D 脫脂奶粉E DTT47變性的DNA會發(fā)生哪些理化性質(zhì)的變化( )A 粘度下降B 沉降速度增加C 浮力下降D 紫外光吸收增加E 紫外光吸收減少48.下列物質(zhì)適于非放射性探針標(biāo)記的是( )A AKP B ACP C 生物素 D 地高辛E 熒光素49關(guān)于人工合成的寡核苷酸探針,下列描述正確的是( )A 特異性高 B 可依賴氨基酸序列推測其序列 C 分子量小 D 可用于相似基因順序差異性分析 E 可用末端轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行5端標(biāo)記50通過哪些措施可以提高雜交反應(yīng)的速度( )A 采用大片段探針B 少量的反應(yīng)體積C 高反應(yīng)溫度D 不斷的振

13、搖E 大量的反應(yīng)體積51關(guān)于切口平移法下述正確的是( )A 可標(biāo)記線性DNA B 可標(biāo)記松散螺旋DNA C 可標(biāo)記超螺旋DNA D 可標(biāo)記存在缺口的雙鏈DNA E 可標(biāo)記隨機(jī)引物52以下哪些方法可以用于從凝膠上轉(zhuǎn)移DNA( )A 毛細(xì)轉(zhuǎn)移B 真空轉(zhuǎn)移C 負(fù)壓轉(zhuǎn)移D 電泳轉(zhuǎn)移E 冷凍轉(zhuǎn)移53關(guān)于隨機(jī)引物法標(biāo)記探針下述正確的是( )A 可標(biāo)記單鏈DNAB 可標(biāo)記雙鏈RNA C 可標(biāo)記單鏈RNA D 比活性高達(dá)108cpmµg DNA以上 E 常經(jīng)過SephadexG-50純化才可使用54可以采用哪些方法來標(biāo)記探針( )A 雜交標(biāo)記法B 切口平移標(biāo)記法C 5-末端的標(biāo)記D 3-末端的標(biāo)記E

14、 化學(xué)法延長標(biāo)記55整個雜交反應(yīng)主要以下哪些步驟組成( )A 預(yù)雜交B 雜交C 洗脫D 固定E 轉(zhuǎn)移56放射自顯影可以被分為( )A 直接放射自顯影B 氧化顯影C 封閉顯影D 間接放射自顯影E 固定顯影57關(guān)于電轉(zhuǎn)移下列描述正確的是( )A 快速、高效 B 需要特殊設(shè)備 C 緩沖液用TAE或TBE D 可產(chǎn)生高溫 E 常用NC膜作為支持介質(zhì)58預(yù)雜交的主要目的是( )A 平衡濾膜B 封閉非特異性雜交的位置C 提高雜交信號的檢測效率D 便于從濾膜上除去探針E 清除用于雜交反應(yīng)檢測的顯色物質(zhì)59.關(guān)于非放射性探針標(biāo)記,下列描述正確的是( )A 對人體危害小 B 需要特殊設(shè)備 C 可長時間使用 D

15、靈敏度不如放射性探針 E 重新雜交新探比較容易60對于改變DNA片段長度的突變,可以由于缺失或插入產(chǎn)生,或由于限制性酶切位點(diǎn)改變而導(dǎo)致限制性片段長度改變??梢酝ㄟ^哪些方法檢測( ) A PCR擴(kuò)增B RAPDC Southerm印跡雜交D Northern印跡雜交E 以上都不是 61重組DNA的篩選可用核酸分子雜交的方法,常用于檢測DNA的雜交方法有哪些( )A 菌落印跡雜交B Northern印跡雜交 C Western印跡雜交D 原位雜交 E 斑點(diǎn)雜交62關(guān)于RNA探針的描述下列正確的是( )A 可用于隨機(jī)引物標(biāo)記 B 特異性高 C 靈敏度高 D 可用非同位素標(biāo)記法標(biāo)記 E 不易降解63下

16、列哪些可以作為核酸探針使用( )A microRNAB 單鏈DNAC 寡核苷酸D mRNAE 雙鏈RNA64關(guān)于核酸探針的描述下列正確的是( )A 可以是DNA B 可以是RNA C 可用放射性標(biāo)記 D 可用非放射性標(biāo)記 E 必須是單鏈核酸(三)問答題1根據(jù)哪三種不同的分類標(biāo)準(zhǔn)可以將雜交分為哪幾類?2簡述反義核酸技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用范圍3試述Northern blot雜交的操作步驟?4什么是肽核酸?并簡述其應(yīng)用?5請舉例說明雜交技術(shù)在臨床檢驗(yàn)科基因診斷方面的應(yīng)用。6請敘述雜交探針標(biāo)記方法的種類。7簡述直接放射自顯影的原理。參考答案(一) 名詞解釋1原位雜交:是首先應(yīng)用核酸探針與組織或細(xì)胞中的

17、核酸按堿基互補(bǔ)配對原則進(jìn)行特異性結(jié)合形成雜交體,然后應(yīng)用組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法在顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)基因定位或基因表達(dá)的檢測技術(shù)。2核酸分子雜交技術(shù):單鏈的核酸分子在合適的條件下,與具有堿基互補(bǔ)序列的異源核酸形成雙鏈雜交體的過程稱作核酸分子雜交。利用核酸分子雜交檢測靶序列的一類技術(shù)稱核酸分子雜交技術(shù)。3探針:是一段單鏈或雙鏈核苷酸,用放射性核素或非放射性物質(zhì)標(biāo)記其末端或全鏈,可依堿基配對規(guī)律與具有互補(bǔ)序列的待測核酸進(jìn)行雜交,以探測它們的同源程度。這一段標(biāo)記的核苷酸被稱為探針。4反向點(diǎn)雜交:是將多種探針固定在同一膜上,同時參與檢測的樣品DNA又互不干擾,故能一次性篩查出多種不同的序列,而不是像

18、傳統(tǒng)的雜交法,一次僅能檢測一個未知序列。5缺口平移標(biāo)記法:該法是利用低濃度DNase I在DNA雙鏈上隨機(jī)切開若干個切口,然后利用E. coli DNA聚合酶I的5®3外切酶活性和5 ®3聚合酶活性,使DNA鏈上的核苷酸不斷被切除,而帶放射性核素標(biāo)記的dNTP不斷地被填入缺口位置,從而形成兩條鏈被均勻標(biāo)記的高放射活性的探針。6隨機(jī)引物標(biāo)記法:隨機(jī)引物是各種可能序列的寡核苷酸混合物,可以人工合成,也可以使用小牛胸腺DNA的DNase I降解物。隨機(jī)引物在較低的退火溫度下,能與各種單鏈DNA模板結(jié)合。首先使雙鏈DNA分子變性成為單鏈,然后退火使隨機(jī)引物結(jié)合于兩條單鏈模板上,當(dāng)反

19、應(yīng)液中存在的4種dNTP中有一種帶放射性核素標(biāo)記時,在DNA聚合酶催化下合成新的帶標(biāo)記的DNA鏈。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)純化即可得到標(biāo)記的DNA探針。7末端標(biāo)記法:寡核苷酸探針由于較其他類型的探針短,需要采用末端標(biāo)記法。該法需要DNA分子的末端帶有羥基,而人工合成寡核苷酸的5端本身即為羥基。其原理是利用多核苷酸激酶將g-32P ATP分子上7位磷酸基轉(zhuǎn)移至寡核苷酸鏈的5末端,末端標(biāo)記也可在3端進(jìn)行。8Southern blot雜交:是研究DNA圖譜的基本技術(shù),在遺傳診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價(jià)值。Southern印跡雜交的方法是將標(biāo)本DNA用限制性內(nèi)切酶消化后,經(jīng)瓊脂糖電泳分離各酶

20、切片段,接著,使酶切片段DNA發(fā)生變性并轉(zhuǎn)印到一固相支持物 (通常是硝酸纖維素薄膜或尼龍膜)上,經(jīng)固定后和標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。這種方法不僅可以檢測DNA樣品中是否存在某一特定的基因,而且還可以獲得基因片段的大小及酶切位點(diǎn)分布的信息。9熒光原位雜交:是一種利用非放射性的熒光信號對原位雜交樣本進(jìn)行檢測的技術(shù)。它將熒光信號的高靈敏度、安全性,熒光信號的直觀性和原位雜交的高準(zhǔn)確性結(jié)合起來,通過熒光標(biāo)記的DNA探針與待測樣本的DNA進(jìn)行原位雜交,在熒光顯微鏡下對熒光信號進(jìn)行辨別和計(jì)數(shù),從而對染色體或基因異常的細(xì)胞、組織樣本進(jìn)行檢測和診斷,為各種基因相關(guān)疾病的分型、預(yù)前和預(yù)后提供準(zhǔn)確的依據(jù)。10菌落雜交:用

21、于重組細(xì)菌克隆篩選的固相雜交,稱菌落雜交,主要步驟包括:菌落平板培養(yǎng);濾膜滅菌后放到細(xì)菌平板上,是菌落粘附到經(jīng)適當(dāng)飽和的吸水紙上;菌斑溶解產(chǎn)生單練的DNA、固定DNA,用32P標(biāo)記的探針與菌落進(jìn)行雜交;雜交后,洗脫未結(jié)合的探針,將濾膜暴露于X線膠片進(jìn)行放射自顯影;將自顯影膠片、濾膜、培養(yǎng)平板相比較,就可以確定陽性菌落。(二)選擇題【A型題】1A 2E 3D 4B 5E 6A 7C 8B 9C 10B 11A 12A 13A 14B 15A 16C 17A 18A 19B 20D 21A 22A 23A 24A 25C 26C 27D 28D 29B 30A 31E 32A 33E 34D 35

22、D 36B 37E 38B 39A 40. B【X型題】41ABCD42ACD43BC44ACDE45BCD46ABCD47ABD48ACDE49ABCD50BCD51ABCD52ABD53ABCD54BCD55ABC56AD57ABCD58AB59ABCD60AC61ADE62ABCD63BCD64ABCD(三)問答題1根據(jù)哪三種不同的分類標(biāo)準(zhǔn)可以將雜交分為哪幾類?根據(jù)雜交核酸分子的種類,可以分為DNA與DNA雜交,DNA與RNA雜交,RNA與RNA雜交;根據(jù)雜交探針標(biāo)記的不同,可以分為同位素雜交和非同位素雜交;根據(jù)雜交介質(zhì)的不同,可以分為液相雜交、固相雜交和原位雜交;其中固相雜交又可以分為

23、菌落雜交、Southern雜交、Northern雜交、點(diǎn)雜交和狹縫雜交。2簡述反義核酸技術(shù)的基本原理及其應(yīng)用范圍反義核酸技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)新的生物技術(shù)。它是根據(jù)堿基互補(bǔ)的原理,設(shè)計(jì)出能特異地同相應(yīng)靶基因結(jié)合的RNA或DNA,從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯,以達(dá)到調(diào)控靶基因表達(dá)的目的。反義核酸技術(shù)包括反義RNA技術(shù),反義DNA技術(shù)及核酶技術(shù)。3試述Northern blot雜交的操作步驟?RNA的變性瓊脂糖電泳;將硝酸纖維薄膜放在含有RNA電泳條帶的凝膠上;轉(zhuǎn)印盤中的轉(zhuǎn)移緩沖液將逐漸為膠和膜上覆蓋的吸水紙吸收,從而利用毛細(xì)作用將膠中的變性RNA分子轉(zhuǎn)移到硝酸纖維薄膜上;轉(zhuǎn)印完成后,使RNA分

24、子固定到膜上;膜上的RNA分子與探針雜交;經(jīng)放射自顯影或其他檢測技術(shù)顯示出雜交區(qū)帶。4什么是肽核酸?并簡述其應(yīng)用?肽核酸是一種全新的DNA類似物,在20世紀(jì)90年代由丹麥科學(xué)家發(fā)明。肽核酸中以中性的肽鏈酰胺2-氨基乙基苷氨酸鍵取代了DNA中的戊糖磷酸二酯鍵,其余結(jié)構(gòu)與DNA相似。PNA可以通過堿基互補(bǔ)配對的形式識別并結(jié)合DNA或RNA序列,形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。由于PNA不帶電荷,與DNA和RNA之間不存在靜電斥力,因而結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性都大為提高;PNA與DNA或RNA的雜交能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于DNA、DNA或DNA、RNA雜交,表現(xiàn)在很高的雜交穩(wěn)定性、優(yōu)良的特異性,而且不被蛋白酶和核酸酶水解等方

25、面。鑒于上述諸多優(yōu)點(diǎn),近年來,PNA被廣泛應(yīng)用在許多高科技領(lǐng)域。如:病原體、遺傳病的檢測,抗癌、抗病毒反義核酸的研究和應(yīng)用。特別是PNA可取代核酸用于基因芯片的制備,被認(rèn)為是基因芯片的升級產(chǎn)品。PNA還可用于定量PCR分析。隨著對PNA研究的不斷深入,PNA將顯示出更大的優(yōu)越性和更為廣闊的應(yīng)用前景。5請舉例說明雜交技術(shù)在臨床檢驗(yàn)科基因診斷方面的應(yīng)用在臨床檢驗(yàn)科,雜交技術(shù)最常用于基因診斷的例子是鐮狀細(xì)胞貧血病的基因診斷。鐮狀細(xì)胞貧血是一種單基因遺傳性疾病,病因是編碼血紅蛋白的基因發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致編碼b鏈第6位的谷氨酸被纈氨酸取代,表示為b6(A 3)谷纈。在血紅蛋白基因的堿基序列上表現(xiàn)為第6位密碼

26、子GAA突變?yōu)镚TA,也就是在這一位點(diǎn)發(fā)生了A到T的點(diǎn)突變。由于這一突變導(dǎo)致基因內(nèi)部一個MstII限制性酶切位點(diǎn)丟失,因而針對這一情況,可以設(shè)計(jì)與b-珠蛋白基因雜交的核酸探針。先擴(kuò)增靶片斷,并用MstII消化擴(kuò)增的DNA片斷,電泳分離消化的DNA片斷。將DNA片斷轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素薄膜上,采用Southern雜交技術(shù)檢測DNA片斷。以此將正常人、攜帶者和患者區(qū)分開來。此外, 還可以用凝血因子基因探針檢測B型血友病,凝血因子基因探針檢測A型血友病,用胰島素基因探針檢測糖尿病,用苯丙氨酸羥化酶基因探針檢測苯丙酮尿癥。以上都是雜交技術(shù)在臨床檢驗(yàn)科進(jìn)行基因診斷的例子。6請敘述雜交探針標(biāo)記方法的種類探針的標(biāo)記方法可分為放射性核素標(biāo)記法和非放射性核素標(biāo)記法兩大類。(1) 放射性核素標(biāo)記的探針,靈敏度

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