液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定犬血漿中氨氯地平和阿托伐他汀的濃度

1、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法測定犬血漿中氨氯地平和阿托伐他汀的濃度趙曦，岳進(jìn)，張彥玲，何穎娜，楊漢煜；石藥集團(tuán)藥物研究院，河北 石家莊 050051摘要：目的：建立了LC-MS/MS法同時測定犬血漿中氨氯地平和阿托伐他汀的含量。方法：樣品用沉淀蛋白法處理，采用C18柱，流動相為甲醇-2 mmol·L-1醋酸胺+0.5%甲酸水溶液（6832，）流動相，以地西泮為內(nèi)標(biāo)，電噴霧離子化，以正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM），檢測離子分別為m/z409.2® m/z238.1（氨氯地平），m/z559.2® m/z440.5（阿托伐他汀）和m/z285.1® m/z193

2、.1（內(nèi)標(biāo)，地西泮）。結(jié)果：氨氯地平在0.120.0 g·L-1、阿托伐他汀在0.250.0 g·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，最低定量限氨氯地平為0.1g·L-1、阿托伐他汀為0.2g·L-1，方法回收率均大于94%，日內(nèi)、日間RSD均小于8.8%。結(jié)論：此法專屬、靈敏、準(zhǔn)確，適用于頭孢克洛臨床藥物動力學(xué)的研究。關(guān)鍵詞：氨氯地平；阿托伐他?。灰合嗌V-串聯(lián)質(zhì)譜法；血藥濃度 中圖分類號： 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：Determination of Amlodipine and Atorvastatin in Beagle dogs Plasma by L

3、C-MS/MSYUE Jin，ZHAO Xi， ZHANG Yan-ling ，HE Ying-na，YANG Han-yu*(Pharmaceutical Research Institute of Shijiazhuang Pharmaceutical Group Co.,Ltd.，Shijiazhuang 050051)Abstract: OBJECTIVE：A LC-MS/MS method was established for the determination of amlodipine and atorvastatin in Beagle dogs plasma. METHOR

4、DS： The samples were precipitated with methanol. A C18 column was used with the mobile phase of methanol-2mmol·L-1+0.5%formic acid (6832,).Diazepam was used as internal standard. ESI was applied and operated in positive ion mode. The detected ions were m/z409.2 m/z238.1(amlodipine), m/z559.2 m/

5、z440.5(atorvastatin) and m/z285.1m/z193.1(diazepam). RESULTS：The calibration curve was linear in the range of 0.120.0 g·L-1 (amlodipine) and 0.2 50.0 g·L-1 (atorvastatin),respectively.The low limit of quantification was 0.1g·L-1 (amlodipine) and 0.2 g·L-1 (atorvastatin),respectiv

6、ely.The average recovery was more than 94%. The RSDs of intra- and inter-day were all less than8.8 %. Conclusion：The method was proved to be specific, sensitive and accurate, and suitable for clinical pharmacokinetics studies of cefaclor.KEY WORDS：amlodipine；atorvastatin；LC/MS/MS；plasma concentratio

7、n CADUET是由抗高血壓藥氨氯地平（Amlodipine，AM）和降脂藥阿托伐他?。ˋtorvastatin，AT）混合而制成的復(fù)方制劑。該藥物適用于同時患有高血壓和高脂血癥的患者，其可以有效的控制血壓和血脂水平，提高服藥的順應(yīng)性，有效治療和預(yù)防心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生，同時降低患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。由于該復(fù)方產(chǎn)品具有良好的療效，因此對其進(jìn)行了大量的研究，為滿足臨床前及臨床藥代動力學(xué)研究的需要，要求建立一種有效的分析方法。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道采用HPLC法、LC-MS法分別測定AM或AT的濃度16。本研究建立了LC-MS/MS法同時測定血漿樣品中AM和AT兩種組分的含量，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性

8、好，血漿樣品前處理方法快速、簡便，可用于復(fù)方AM和AT制劑的臨床前藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)研究。1 儀器與試藥API 4000型液相色譜三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子化ESI源，Analyst 1.4 軟件（美國ABI公司）；Agilent 1100色譜系統(tǒng)（含四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，自動進(jìn)樣器，柱溫箱；美國安捷倫公司）。馬來酸左旋氨氯地平對照品（河北省藥品檢驗(yàn)所，含量為99.2%，批號0269-9701）；阿托伐他汀鈣對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量為99.2%，批號100590-200501）；地西泮（內(nèi)標(biāo)，IS）對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量：99.1%，批號1225-96

9、01）；馬來酸左旋氨氯地平（石家莊歐意藥業(yè)有限公司提供，含量：99.8%，生產(chǎn)批號：109060901）；阿托伐他汀鈣（石家莊歐意藥業(yè)有限公司提供，含量：99.1%，生產(chǎn)批號：20061001）；甲醇、甲酸和醋酸胺均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為娃哈哈純凈水。2 方法與結(jié)果2.1 液相色譜條件 色譜柱：美國Waters公司 Atlantis dC C18柱（100 × 2.1mm，3 mm）；流動相：甲醇2 mmol·L-1醋酸胺+0.5%甲酸水溶液（6832）；流速0.3mL·min-1；進(jìn)樣量20L；柱溫20。2.2 質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子化（ESI）源；噴霧電壓

10、IS 4500V；霧化溫度500 ；霧化氣40L·min-1；簾氣25L/min；碰撞氣6L·min-1；輔助氣30L·min-1；。檢測方式為正離子多離子反應(yīng)監(jiān)測（MRM），檢測離子反應(yīng)分別為m/z409.2® m/z238.1（AM），m/z559.2® m/z440.5（AT），m/z285.1® m/z193.1（IS）。質(zhì)譜圖見圖1，碰撞誘導(dǎo)解離電壓分別為15V（AM），35V（AT）和30V（內(nèi)標(biāo)，IS）；駐留時間（dwell time）均為200ms。2.3 溶液配制AM標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取馬來酸左旋氨氯地平對照品32.4

11、mg（相當(dāng)于AM 25.0mg），置25 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得1.0 g·L-1的1貯備液；依次用甲醇稀釋成1.0，2.0，5.0，15.0，50.0，200.0 g·L-1的AM標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。AT標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取阿托伐他汀鈣對照品26.0mg（相當(dāng)于AM 25.0mg），置25 mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得1.0 g·L-1的AT貯備液；依次用甲醇稀釋成2.0，5.0，15.0，50.0，150.0，500.0 g·L-1的AT標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取IS對照品25.3mg，置于25mL量瓶中，以甲醇溶解并定容，得1.0 g&

12、#183;L-1的IS貯備液；再用甲醇稀釋成100 g·L-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液。2.4 血漿樣品處理 精密吸取血漿樣品0.1mL，置2mL離心管中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液0.2mL，精密加入甲醇溶液0.2mL，旋渦混合0.5min，離心（10000r·min-1）5min；精密吸取上清液0.1mL，置2mL離心管中，加入流動相0.2mL，旋渦混合0.5min，取20mL進(jìn)行LC-MS/MS分析。2.5 專屬性試驗(yàn) 空白血漿，空白血漿加入AM（0.1 g·L-1）、AT（0.2 g·L-1）和IS（100 g·L-1）和健康受試動物給藥3h后血漿樣品的色

13、譜圖見圖2。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測物和內(nèi)標(biāo)的測定。AM、AT和IS的保留時間分別為1.55min、4.35min和3.57min。2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限取空白犬血漿0.8ml，分別加入AM和AT標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各0.1mL，得到分別相當(dāng)于AM血漿濃度為0.1，0.2，0.5，1.5，5.0，20.0 g·L-1和AT血漿濃度為0.2，0.5，1.5，5.0，15.0，50.0 g·L-1的標(biāo)準(zhǔn)系列血漿工作液，精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)系列血漿工作液0.1mL，其余按 “2.4”項(xiàng)下操作，分別以AM和AT濃度c為橫坐標(biāo)，分別以1、2與內(nèi)標(biāo)3的峰面積比R為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最

14、小二乘法（1/c2）進(jìn)行回歸7，得回歸方程分別為：R =0.0745c+0.00301，（r=0.9990， 1），R =0.0253c+0.00518，（r=0.9995，2）。表明，AM濃度在0.120.0 g·L-1、AT濃度在0.250.0 g·L-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。AM、AT的最低定量限分別為0.1 g·L-1、0.2 g·L-1。ABCA：AM的ESI一級質(zhì)譜圖（I）和二級質(zhì)譜圖（II）；B：AT的ESI一級質(zhì)譜圖（I）和二級質(zhì)譜圖（II）；C：IS的ESI一級質(zhì)譜圖（I）和二級質(zhì)譜圖（II）圖1 AM、AT和IS的質(zhì)譜圖2.7 精密度

15、與回收率8按“2.6”項(xiàng)下方法制備含有AM和AT的低、中、高3個濃度（AM為0.2，1.5，15.0 g·L-1；2為0.5，5.0，40.0 g·L-1）的血漿質(zhì)控樣品，每個濃度6份，連續(xù)測定3批，進(jìn)行方法學(xué)確證，以同批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品AM、AT的濃度。計(jì)算得AM的日內(nèi)RSD（%，n=6）分別為4.3、2.7、1.7，日間RSD（%，n=6）分別為7.0、5.6、5.7；AT的日內(nèi)RSD（%，n=6）分別為1.8、3.8、4.3，日間RSD（%，n=6）分別為3.4、8.7、5.5。方法回收率，AM的分別為100.5%、100.3 %、101.7%；AT的分別為97.4

16、%、96.5 %、94.6%。內(nèi)標(biāo)溶液經(jīng)同法處理，其回收率為99.7%。ABCA：空白血漿；B：空白血漿+AM（0.1g·L-1）+AT（0.2 g·L-1）+IS（100 g·L-1）；C：受試者服藥3h后血樣-AM；-AT；-IS圖2 血漿中AM、AT及內(nèi)標(biāo)IS的MRM色譜圖2.8 穩(wěn)定性考察 分別考察AM（濃度分別為0.2和15.0 g·L-1）和AT（濃度分別為0.5和40.0 g·L-1）血漿樣品中室溫放置4 h、預(yù)處理后室溫放置24 h、凍融3次和-20凍存30d的穩(wěn)定性，所得AM濃度的RSD（%，n=3）分別為5.1和2.3、5.

17、3和3.0、3.1和1.4、2.9和3.5；所得AT濃度的RSD（%，n=3）分別為3.5和1.9、4.5和2.5、1.8和1.7、2.4和1.6。表明在上述條件下AM和AT均穩(wěn)定。2.9 藥動學(xué)研究 6只Beagle犬單劑量口服復(fù)方馬來酸左旋氨氯地平/阿托伐他汀鈣膠囊（劑量配比為：AM:AT=0.125mg/Kg:1.0mg/Kg），其給藥后的血藥濃度-時間曲線見圖3。圖3 Beagle犬單劑量給藥后AM和AT的平均藥-時曲線（n=6）3 討論3.1 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，國內(nèi)采用LC-MS/MS1,4、HPLC法2,5測定血漿中的1或2濃度，HPLC法不僅靈敏度低，而且分析周期較長。LC-MS/MS

18、方法，僅見分別單獨(dú)測定血漿中的1或2，若按文獻(xiàn)方法測定給予復(fù)方馬來酸左旋氨氯地平/阿托伐他汀鈣膠囊后的犬血漿樣品，前處理方法不同，無法同時測定兩種組分，只能分別測定，從而造成血漿用量大大增加。本研究所建立的LC-MS/MS方法，認(rèn)真摸索了血漿樣品前處理方法和色譜、質(zhì)譜分析條件，將兩種在理化性質(zhì)和色譜行為方面存在較大差異的物質(zhì)同時進(jìn)行測定，而且克服了基質(zhì)效應(yīng)、殘留污染等的影響。采用本文所建立的LC-MS/MS方法對血漿樣品進(jìn)行分析，樣品用量少（僅用0.1ml血漿樣品），血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾，方法的靈敏度和選擇性高（AM最低定量濃度為0.1 ng/ml，AT最低定量濃度為0.2 ng/ml

19、），而且大大縮短了分析周期，每個樣品所需分析時間僅為5.5分鐘。該方法回收率較高且穩(wěn)定，靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度均較高，專屬性強(qiáng)，本方法靈敏、快速、簡便，已成功用于臨床前藥代動力學(xué)和毒代動力學(xué)的研究。3.2 本研究曾考察過液-液提取和固相萃取等多種血漿樣品處理方法，但由于理化性質(zhì)的差異無法采用同一種提取條件將AM和AT同時提??；而固相萃取時所采用的高有機(jī)比例的洗脫液，容易使1和2出現(xiàn)嚴(yán)重的溶劑效應(yīng)，影響AM和AT的測定。因此，經(jīng)考察最終采用沉淀蛋白法對血漿樣品進(jìn)行處理。參考文獻(xiàn)：1 ZHANG Y，CHEN X Y，ZHONG D F et alAssessment of pharmacokin

20、etics and bioequivalence amlodipine besylate in healthy volunteersJJ Fourth Mil Med Univ（第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)），2006，27（2）：1722 YUAN G P，CHEN S Z，JIN N B et alReversed Pharse HPLC Determination of Amlodipine in Human PlasmaJStrait Pharmaceutical Journal（海峽藥學(xué)），2004，16（4）：513 Tatar S，Atmaca SDetermination of amlodipine in human plasma by high-performance liquid chromatography fluorescence detection JJ chromatogy B Biomed Sci Appl，2001，758：3054 DI X H，YANG Y G，MEI W et alStudies on bioequivalence of atorvastatin calcium capsules JPharm J Chin PLA（解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)），2005，21（4）：2625 SHEN H R，LI