實(shí)驗(yàn)二 雙水相萃取α淀粉酶分配平衡

1、實(shí)驗(yàn)二 雙水相萃取 -淀粉酶的分配平衡實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求1掌握雙水相萃取技術(shù)的基本原理和主要影響因素。 2了解目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)如等電點(diǎn)、電荷和分子量等。3掌握熟悉聚乙二醇(PEG /硫酸銨體系雙水相萃取實(shí)驗(yàn)操作。4明確 PEG 分子量、硫酸銨濃度、 pH 和添加 NaCl 等因素對(duì) -淀粉酶分配系數(shù)的影響。 二、實(shí)驗(yàn)器材和試劑1. 實(shí)驗(yàn)器材 :低速離心機(jī);酸度計(jì);渦流混合器;分光光度計(jì)2. 實(shí)驗(yàn)試劑 :PEG :(分子量分別為 1000、 2000、 4000、 6000、 8000 、硫酸銨、 -淀粉酶、 磷酸氫二 鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉、考馬斯亮藍(lán) G-250 三、實(shí)驗(yàn)原理雙水相萃取技術(shù)

2、在萃取胞內(nèi)酶中應(yīng)用廣泛,最常采用的雙水相體系是 PEG/Dex或 PEG/低分子鹽系統(tǒng), 其中低分子鹽最常采用的是硫酸銨、磷酸鉀和硫酸鎂。 PEG/磷酸鉀雙水相體系相圖如上所示。 T 為上相濃度, B 為下相濃度 , C 為系統(tǒng)臨界點(diǎn), TCB 為臨界線 或雙節(jié)線,雙節(jié)線以上為兩相區(qū)、以下為一相區(qū)或均相區(qū)。因此兩相濃度要足夠高才可以形成兩相。雙水 相萃取分配系數(shù) K=Ct /Cb ,為上相和下相的濃度比。雙水相系統(tǒng)分配系數(shù)的影響因素包括系統(tǒng)本身的因素如系統(tǒng)組成、聚合物分子量、聚合物濃度、鹽和 離子強(qiáng)度、 pH 等,以及目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)如疏水作用、電荷、等電點(diǎn)和分子量等。利用雙水相技術(shù)可以獲得 特

3、定蛋白質(zhì)和生物大分子的最適宜分離的相系統(tǒng)和最優(yōu)分配。相圖中 TMB 為系線,其長(zhǎng)度由相組成的總濃度決定,表征兩相差異程度。在臨界點(diǎn)附近系線長(zhǎng)度趨 近于零,表示上相和下相的組成相同,因此分配系數(shù)應(yīng)為 1。隨著 PEG 、硫酸銨和鹽濃度增大,系線長(zhǎng)度 增加,上相和下相相對(duì)組成的差別就增加,酶在兩相中的分配系數(shù)會(huì)受到極大的影響。本實(shí)驗(yàn)采用 PEG/硫酸銨雙水相體系研究 -淀粉酶的分配,具體研究 PEG 分子量、硫酸銨濃度、 pH 和 添加 NaCl 濃度對(duì) -淀粉酶分配系數(shù)的影響。參考:-淀粉酶是廣泛應(yīng)用的生物酶類, B.Subtilis 細(xì)菌 -淀粉酶是研究和應(yīng)用較多的 -淀粉酶, 其分子量為 4

4、8 KD , PI 約為 5,最適 pH5.3-6.4,在 pH4.8-8.5之間穩(wěn)定。四、實(shí)驗(yàn)步驟1. PEG/硫酸銨雙水相體系相圖繪制(全班都做配制 40%PEG1000和 43%硫酸銨原液(沒有混合前的液體,混合后濃度是相圖中最終濃度,分別取0.7gPEG1000、 2000、 4000、 6000原液(PEG10002000、 4000、 6000密度分別為 1.037g/mL、 1.066 g/mL 、 1.03 g/mL 、 1.07,因此加入 0.7g 對(duì)應(yīng)體積分別為 0.68 mL、 0.66mL 、 0.68 mL、 0.66 mL ,加入 0.5mL 水,按圖 1流程繪制相

5、圖,按表 1記錄數(shù)據(jù)。注意少量多次加入硫酸銨原液,系統(tǒng)出現(xiàn)渾濁時(shí)記錄加入硫 酸銨體積,計(jì)算重量(43%硫酸銨原液密度為 1.2g /mL , 再加入適量水,使體系變澄清,計(jì)量加入的水, 再加硫酸銨,使系統(tǒng)再次變混濁,如此反復(fù)操作,原液冰箱放置。將數(shù)據(jù)記錄到表 1中,計(jì)算系統(tǒng)混濁不 同時(shí)刻 PEG 和硫酸銨在系統(tǒng)中的質(zhì)量百分濃度(或質(zhì)量體積百分比 ,繪制 PEG 和硫酸銨的雙水相相圖。第 1組同學(xué)做 PEG 分子量 1000的相圖,第 2、 3、 4組分別做 PEG 分子量 2000、 4000和 6000的相圖。 圖 1 PEG/硫酸銨雙水相相圖繪制流程表 1 PEG/硫酸銨雙水相體系相圖繪制

6、數(shù)據(jù) 按圖 2流程,配制 40%PEG2000、 4000、 6000和 8000和 50%硫酸銨原液,混合后雙水相體系為 PEG4000 (20%g/mL 硫酸銨 (25%g/mL。分別取 4mL PEG和硫酸銨原液各 2份,一份做上下相空白樣,加入 0.5mL 水, 另一份加入 0.5mL 淀粉酶用于雙水相分配置于 15mL 刻度離心管中軸向充分混合, 3000r/min離心 4min ,讀 出上下相體積,計(jì)算相比。小心吸取上相 1mL, 加入 3mL 考馬斯亮藍(lán),測(cè)定 595nm 下的吸光度 A 值。移去上相,棄去相界面處液體和 少量下相,小心吸取下相 1mL, 加入 3mL 考馬斯亮藍(lán)

7、,測(cè)定 595nm 下的吸光度 A 值。添入表 2,計(jì)算分配系數(shù) , 繪制趨勢(shì)圖。 (實(shí)驗(yàn) 2、 3、 4、 5步驟均采用此方法測(cè)定上下相吸光度值,根據(jù)蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算 出酶濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y= 0.8292 X + 0.0272PEG10000.700g2O混均 圖 2 不同變量對(duì)雙水相萃取 -淀粉酶分配系數(shù)影響操作流程 表 2 不同 PEG 分子量對(duì)雙水相萃取 -淀粉酶分配系數(shù)的影響 3分別取 4mL40%PEG4000和 50%硫酸銨原液 8份, 按表 3加入不同 NaCl 濃度后, 空白樣加入 0.5mL 蒸餾 水,樣品加入 0.5mL 淀粉酶置于 15mL 刻度離心管中軸向充

8、分混合, 3000r/min離心 4min ,讀上下相體積, 計(jì)算相比。按步驟 2測(cè)定上下相中淀粉酶吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度和 -淀粉酶分配系數(shù)。4. 不同硫酸銨濃度對(duì)雙水相萃取 -淀粉酶分配系數(shù)的影響(第 3組表 4 不同硫酸銨濃度對(duì) -淀粉酶分配系數(shù)臺(tái)稱 總重 8.5mL求相比R =V上 /V下樣品加入 0.5mL 淀粉酶置于 15mL 刻度離心管中軸向充分混合, 3000r/min離心 4min ,讀上下相體積,計(jì) 算相比。按步驟 2測(cè)定上下相中淀粉酶吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度和 -淀粉酶分配系數(shù)。5. 不同 pH 值對(duì)雙水相萃取 -淀粉酶分配系數(shù)的影響(第 4組取 4mL40%PEG

9、4000 8份,按表 5分別加入不同 pH 值含 50%硫酸銨原液各 2份,空白樣加入 0.5mL 蒸 餾水,樣品加入 0.5mL 淀粉酶置于 15mL 刻度離心管中軸向充分混合, 3000r/min離心 4min ,讀上下相體 積,計(jì)算相比。按步驟 2測(cè)定上下相中淀粉酶吸光度,按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度和 -淀粉酶分配系數(shù)。 對(duì)于 PEG4000 (15%g/mL 硫酸銨 (25% g/mL體系,按表 5記錄不同 pH 值時(shí) -淀粉酶分配系數(shù)。 五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.加完物料后必須將離心試管沿軸向充分振搖,直至固體全部溶解。2. 上下相分離時(shí)注意吸管小心吸出上相,將多余上相和少量下相棄去,換吸管,吸出

10、下相。六、思考題1.常用雙水相體系有哪些? 2.雙水相體系形成的過程?3.雙水相體系形成的原因?4.分析 PEG 分子量、濃度、 pH 、添加 NaCl 和酶濃度等因素對(duì) -淀粉酶分配系數(shù)的影響。 %1. 穿實(shí)驗(yàn)服、預(yù)習(xí)實(shí)驗(yàn)、不要大聲喧嘩。2. 下午一點(diǎn)半 2個(gè)班同時(shí)到實(shí)驗(yàn)室, 1班在 607,2班在 608. 統(tǒng)一在 608講解后分別做實(shí)驗(yàn)。3. 每組任務(wù):相圖,一個(gè)變量對(duì)分配系數(shù)的影響, 1-4組分別做步驟 2、 3、 4、 5.4. 為避免分光光度計(jì)使用時(shí)間沖突,每班第 1組先做變量影響,每 45分鐘后輪換下一組使用。5. 每組選組長(zhǎng)領(lǐng)藥品,實(shí)驗(yàn)結(jié)束后洗干凈交回。每班第 3-4組值日。簽

11、到后檢查無誤給成績(jī)。 % 準(zhǔn)備試劑:(4個(gè)班40%PEG1000、 2000、 4000和 6000 各 200mLL 。 (試劑瓶裝每個(gè) 2瓶 43%硫酸銨原液 500mL, 每組分成 4個(gè)小試管分裝,每管 4mL 。50%硫酸銨原液 150Ml, 每組分成 4個(gè)小試管分裝,每管 4mL 。pH 值分別為 4.8、 5.5、 7.0、 8.5的磷酸鹽緩沖液 100mL. (用于配 50%硫酸銨原液每組各 4mL, 共 4組 NaCl 濃度 0.085g 、 0.2125g 、 0.425g 、 0.663g ,各 4份 , 共 4組。考馬斯亮藍(lán) G-250 800mL, 每組 100mL. (100mg 考馬斯亮藍(lán)、 85%磷酸 120Mml95%乙醇 50mL, 定容至 1L 1%-淀粉酶 10mL (每組 4份,每份 0.5mL 裝在 1mL 離心管中20%、 30%、 40%、 50%硫酸銨各 100mL. (每組各 4mL