土壤酶測(cè)定方法

1、土壤酶活性測(cè)定方法王強(qiáng)鋒土壤脲酶的測(cè)定方法苯酚鈉次氯酸鈉比色法一、原理 脲酶存在于大多數(shù)細(xì)菌、 真菌和高等植物里。 它是一種酰胺酶作用是極為專性的， 它僅能水 解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機(jī) 物質(zhì)含量、 全氮和速效磷含量呈正相關(guān)。 根際土壤脲酶活性較高， 中性土壤脲酶活性大于堿 性土壤。 人們常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素狀況。 土壤中脲酶活性的測(cè)定是以脲素為基 質(zhì)經(jīng)酶促反響后測(cè)定生成的氨量，也可以通過(guò)測(cè)定 未水解的尿素量來(lái)求得。本方法以尿素 為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚 次氯酸鈉作用生成 藍(lán)色的靛酚，來(lái)分析脲酶活性。二、試劑1甲苯 2 10%

2、尿素：稱取 10g 尿素，用水溶至 100ml。 3檸檬酸鹽緩沖液 PH6.7： 184g 檸檬酸和 147.5g 氫氧化鉀 KOH 溶于蒸餾水。將兩溶液合并，用 1mol/LNaOH 將 PH調(diào)至6.7，用水稀釋定容至1000ml。4苯酚鈉溶液1.35mol/L： 62.5g苯酚溶于少量乙 醇，加 2ml 甲醇和 18.5ml 丙酮，用乙醇稀釋至 100mlA 液，存于冰箱中； 27gNaOH 溶 于100ml水B液。將A、B溶液 保存在冰箱中。使用前將 A液、B液各20ml混合，用 蒸餾水稀釋至 100ml 。 5次氯酸鈉溶液：用水稀釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%，溶液穩(wěn)定。6氮的標(biāo)準(zhǔn)溶

3、液：精確稱取0.4717g硫酸銨溶于水并稀釋至 1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的標(biāo)準(zhǔn)液；再將此液稀釋 10倍吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至 100ml丨制成氮的工 作液 0.01mg/ml。三、操作步驟稱取5g 土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加10ml10%尿素溶液和 20ml PH 6.7檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37C恒溫箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后過(guò)濾，過(guò)濾后取 1ml 濾液參加 50ml 容量瓶中，再加 4ml 苯酚鈉溶液和 3ml 次氯酸鈉溶液，隨加隨搖 勻。 20min 后顯色，定容。 1h 內(nèi)在分光光度計(jì)與 578nm 波長(zhǎng)處比色。 靛酚的藍(lán)色在

4、1h 內(nèi) 保持穩(wěn)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在測(cè)定樣品吸光值之前，分別取0、 1、 3、 5、 7、 9、 11、 13ml氮工作液，移于 50ml容量瓶中，然后補(bǔ)加蒸餾水至20ml。再參加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉 溶液，隨加隨搖勻。 20min 后顯色，定容。 1h 內(nèi)在分光光度計(jì)上于 578nm 波長(zhǎng) 處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?？记绊氈? 1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照， 以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)， 其他操作與樣品 實(shí)驗(yàn)相同， 以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣，其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同， 以檢驗(yàn)試劑純 度和

5、基質(zhì)自身分解。 3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的 最大值，那么應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計(jì)算：以24 小時(shí)后 1g 土壤中NH3 N的毫克數(shù)表示土壤脲酶活性 UreUre= a樣品a無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)XVXn/ m式 中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3 N毫克數(shù)；a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的 NH3 N毫克數(shù)；a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3 N毫克數(shù)； V 為顯色液體積； n 為分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積； m 表示烘干土重 土壤磷酸酶活性測(cè)定磷酸苯二鈉比色法、原理測(cè)定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機(jī)基團(tuán)量或無(wú)機(jī)磷量計(jì)算磷酸酶活性。 前一種通常

6、稱為有 有機(jī)基團(tuán)含量法， 是目前較為常用的測(cè)定磷酸酶的方法， 后一種稱為無(wú)機(jī)磷含量法。 研究證 明：磷酸酶有三種最適PH 值： 45、 67、 810。因此，測(cè)定酸性、中性和堿性土壤的磷酸 酶，要提供相應(yīng)的 PH 緩沖液才能測(cè)出該土壤的磷酸酶最大活性。 測(cè)定磷酸酶常用的 PH 緩沖體系有乙酸鹽緩沖液 、檸檬酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、和 硼酸緩沖液 PH910 。磷酸酶測(cè)定時(shí)常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚酞磷酸鈉、甘油磷酸鈉、 a或者 伊萘酚磷酸鈉等。現(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1緩沖液：1醋酸鹽緩沖液醋酸溶液11.55ml 95%冰醋酸溶至1L。醋酸鈉溶液2H3O2W 或27g C2H

7、3O2Na.3H2O溶至1L.取醋酸溶液和醋酸鈉溶液稀釋至1L. 2檸檬酸鹽緩沖液檸檬酸溶液6H7O8溶至磷酸氫二鈉溶液 Na2HPO4 .7H2O或者71.7g Na2HPO4.12H2O溶至1L. 取檸檬酸溶液加磷酸氫二鈉溶液稀釋至100ml. 3硼酸鹽緩沖液硼砂溶液硼砂溶至1L.溶液 8gNaOH 溶至 1L. 取硼砂溶液加溶液稀釋至 200ml. 2 0.5%磷酸苯二鈉用緩沖液配 制3氯代二溴對(duì)苯醌亞胺試劑：稱取0.125g氯代二溴對(duì)苯醌亞胺，用10ml96%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4甲苯 50.3%硫酸鋁溶液6酚標(biāo)準(zhǔn)溶液 酚原液：取1

8、g重蒸酚溶于蒸餾水中，稀釋至1L，存于棕色瓶中。 酚工作液：取 10ml 酚原液稀釋至 1L。三、操作步驟稱 5g 土樣置于 200ml 三角瓶中，加 2.5ml 甲苯，輕搖 15min 后，參加 20ml 0.5%磷酸 苯二鈉 酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液； 中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液； 堿性磷酸酶用硼酸鹽 緩沖液，仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，37C下培養(yǎng)24h。然后在培養(yǎng)液參加 100ml 0.3%硫酸鋁溶液并過(guò)濾。吸取 3ml 濾液于 50ml 容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。用硼酸緩 沖 液時(shí)，呈現(xiàn)藍(lán)色，于分光光度計(jì)上 660nm 處比色。 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取 0、1、3、5、7、 9、11

9、、13ml 酚工作液，置于 50ml 容量瓶中，每瓶參加 5ml 硼酸緩沖液和 4 滴氯代二溴 對(duì)苯醌亞胺試劑，顯色后稀釋至刻度， 30min 后，在分光光度計(jì)上 660nm 處比色。以顯色 液中酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。考前須知 : 1、每一個(gè)樣品應(yīng)該做一個(gè)無(wú)基質(zhì)對(duì)照， 以等體積的蒸餾水代替基質(zhì)， 其他操作與 樣品實(shí)驗(yàn)相同， 以排除土樣中原有的氨對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。2、整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置一個(gè)無(wú)土對(duì)照，不加土樣， 其他操作與樣品實(shí)驗(yàn)相同，以檢驗(yàn)試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，那么應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計(jì)算以24h后1g 土壤中釋放出的

10、酚的質(zhì)量mg表示磷酸酶活性。磷酸酶活性=a樣品a無(wú)土一 a無(wú)基質(zhì)XVXn/m式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)；a無(wú)土為無(wú)土對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)；a無(wú)基質(zhì)為無(wú)基質(zhì)對(duì)照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚毫克數(shù)； V 為顯色液體積； n 為分取倍數(shù)， 浸出液體積/吸取濾液體積； m 表示烘干土 重 土壤蔗糖酶活性測(cè)定 3,5- 二硝基水楊酸比色法、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機(jī)質(zhì)、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強(qiáng)度有關(guān)，一般情況下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的復(fù)原糖與3,5- 二硝基水楊酸反響而生成橙色的3-氨基 -5-硝基水楊酸。 顏色深度

11、與復(fù)原糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定復(fù)原糖量來(lái)表示蔗糖酶的活性。二、試劑1酶促反響試劑： 基質(zhì)8%蔗糖，磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉11.876g W2HPO4 2H2O 溶于1L蒸餾水中加1/15M磷酸二氫鉀9.078g KH 2PO4溶于1L蒸餾水中9.5ml即成， 甲苯2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1mg/mL丨預(yù)先將分析純葡萄糖置80C烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻冰箱中4 C保存期約一星期。假設(shè)該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，那么應(yīng)棄之，重新配制。3 3,5-二硝基水楊酸試劑 DNS 試劑稱二硝基水楊酸，溶于 20ml 2mol/LNa

12、OH 和 50ml 水中， 再加30g酒石酸鉀鈉，用水稀釋定容至100ml保存期不過(guò) 7天。三、操作步驟1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別吸 1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液 0、于試管中，再補(bǔ)加蒸餾 水至1mL ,加DNS試劑3mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反響 5min從試管放入重新沸騰時(shí) 算起，取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng)540nm處比色，以 OD值為縱坐標(biāo)，以葡 萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2土壤蔗糖酶測(cè)定 稱取 5g 土壤，置于 50mL 三角瓶中，注入 15ml 8%蔗糖溶液， 5ml pH 5.5 磷酸緩沖液 和5滴甲苯。搖勻 混合物后，放入恒溫箱，在37C下培養(yǎng)24h。到時(shí)取

13、出，迅速過(guò)濾。從中吸取濾液 1ml,注入50ml容量瓶中，加3ml DNS試劑，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min,隨 即將容量瓶移至自來(lái)水流下冷卻 3min。溶液因生成 3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸餾水稀釋至 50ml ，并在分光光度計(jì)上于 508nm 處進(jìn)行比色。為了消除土壤中原有的蔗糖、 葡萄糖而引起的誤差， 每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照， 整個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照； 如果樣品吸光 值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，那么應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。四、結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性以24h， 1g 干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。 結(jié)果計(jì)算：蔗糖酶活性=a樣品a無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)h/m a樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)

14、分別表示其 由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)； n 為分取倍數(shù)； m 表示烘干土重 土壤纖維素酶活性測(cè)定 3,5- 二硝基水楊酸比色法一、原理 纖維素是植物殘?bào)w進(jìn)入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用下， 它的最 初水解產(chǎn)物是纖維二糖，在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡萄糖。所以，纖維素酶是碳素循環(huán)中的一個(gè)重要的酶。纖維素酶解所生成的復(fù)原糖與3,5- 二硝基水楊酸反響而生成橙色的 3-氨基 -5-硝基水楊酸。顏色深度與復(fù)原糖量相關(guān)，因而可用測(cè)定復(fù)原糖量來(lái)表示蔗糖 酶的活性。二、試劑1甲苯 2 1%羧甲基纖維素溶液： 1g 羧甲基纖維素鈉，用 50%的乙醇溶至 100ml。 3 pH5.5

15、醋酸鹽緩沖液：醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至醋酸鈉溶液 16.4g C2H3O2Na 或 27.22g C2H3O22O溶至1L.取醋酸溶液和醋酸鈉溶液混勻即成醋酸鹽緩沖液 .43,5-二硝基水楊酸溶液： 稱二硝基水楊酸， 溶于 50ml 2mol/LNaOH 和 125ml 水中， 再加 75g 酒石酸 鉀鈉，用水稀釋至 250ml保存期不過(guò) 7天，5葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1mg/mL丨預(yù)先將分析 純葡萄糖置80 C烘箱內(nèi)約12小時(shí)。準(zhǔn)確稱取 50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸餾水溶解后， 移至50mL容量瓶中，定容，搖勻冰箱中4 C保存期約一星期。假設(shè)該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)象，那么應(yīng)棄

16、之，重新配制。三、操作步驟葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別吸 1mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液 0、 0.8mL 于試管中，再補(bǔ) 加蒸餾水至1mL ,加DNS溶液3ml混勻，于沸騰水浴中加熱 5min ,取出立即泠水浴中 冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長(zhǎng) 540nm 處比色，以 OD 值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖 濃度為 橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 稱 10g 土壤置于 50ml 三角瓶中，參加 1.5ml 甲苯，搖勻后放置 15min，再加5ml 1%羧 甲基纖維素溶液和 5ml pH5.5醋酸鹽緩沖液，將三角瓶放在37 C恒溫箱中培養(yǎng) 72h。培養(yǎng)結(jié) 束后，過(guò)濾并取1ml濾液，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測(cè) 定。 為了

17、消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無(wú)基質(zhì)對(duì)照，整 個(gè)試驗(yàn)需做無(wú)土壤對(duì)照；如果樣 品吸光值超過(guò)標(biāo)曲的最大值，那么應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少 培養(yǎng)的土樣。 四、結(jié)果計(jì)算 纖維素酶活性以 72h， 1g 干土生成葡萄糖毫克數(shù)表示。 纖維素酶活性 =a 樣品 a 無(wú)土 a無(wú)基質(zhì)xn/ m a樣品、a無(wú)土、a無(wú)機(jī)質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖毫克數(shù)； n 為分取倍數(shù)； m 表示烘干土重 過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定高錳酸鉀滴定法一、原理過(guò)氧化氫廣泛存在于生物體和土壤中， 是由生物呼吸過(guò)程和有機(jī)物的生物化學(xué)氧化反響的結(jié) 果產(chǎn)生的， 這些過(guò)氧化氫對(duì)生物和土壤具有毒害作用。 與此同時(shí)， 在生物體和土壤

18、中存有過(guò) 氧化氫酶，能促進(jìn)過(guò)氧化氫分解為水和氧的反響H2O2T H2O+O2，從而降低了過(guò)氧化氫的毒害作用。 土壤中過(guò)氧化氫酶的測(cè)定便是根據(jù)土壤 含有過(guò)氧化氫酶 和過(guò)氧化氫作用析 出的氧氣體積或過(guò)氧化氫的消耗量， 測(cè)定過(guò)氧化氫的分解速度， 以此代表過(guò)氧化氫酶的活性。 測(cè)定過(guò)氧化氫酶的具體方法比擬多， 如氣量法： 根據(jù)析出的氧氣體積來(lái)計(jì)算過(guò)氧化氫酶的活 性； 比色法：根據(jù)過(guò)氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來(lái)表征過(guò)氧化氫酶的活 性；滴定法： 用高錳酸鉀溶液滴定過(guò)氧化氫分解反響剩余過(guò)氧化氫的量，表示出過(guò)氧化氫酶的活性。本實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)采用高錳酸鉀滴定法。二、試劑2mol/L H 2SO4溶液量取5.43ml的濃硫酸稀釋至 500ml，置于冰箱貯存高錳酸鉀溶液：稱取 高錳酸鉀，參加 400mL水中，緩緩煮沸 15min，冷卻后定容至 500mL，避光保存，用時(shí) 用草酸溶液標(biāo)定；草酸溶液：稱取優(yōu)級(jí)純H2C2O4?2H2O 3.334g,用蒸餾水溶解后，定容至250ml; 3%的H2O2水溶液：取 30% H2O2溶液25ml，定容至 250ml，置于冰箱貯存， 用時(shí)用MnO4溶液標(biāo)定。三、操作步驟 操作步驟分別取5g 土壤樣品于具塞三角瓶中用不加土樣的作空白對(duì)照，參加甲苯，搖勻，于4C冰箱中放置 30min。取出，立刻參加 25mL冰箱貯存的3% H2O2水溶液，充分混勻后，再 置于冰箱