生物克隆基因的表達形式

1、生物克隆基因的表達形式基因的表達:指遺傳信息從DNA到RNA再到蛋白質(zhì)的過程promoterOperatorStructural geneterminatorG1G2G31、閱讀框架：指基因的編碼區(qū)，包含從起始密碼子至翻譯終止密碼子之間的cDNA序列。2、順式作用元件順式作用元件對基因轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控啟動子啟動子增強子增強子沉默子沉默子順式作用元件對轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控終止子衰減子是RNA聚合酶識別,結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的一段DNA序列,長度隨生物種類不同而異.主要特征:l序列特異性:l方向性:結(jié)構(gòu)一般是不對稱的，正反兩個方向只有一種具有啟動功能l位置特異性l種屬特異性:遠距離調(diào)節(jié)啟動子并提高轉(zhuǎn)錄效率的一段

2、DNA序列,由多個元件組成,每個元件可與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合.最早在SV40中發(fā)現(xiàn),作用方式特點:l雙向作用l提高轉(zhuǎn)錄效率l無位置效應(yīng)l遠距離作用l組織特異性:只能在特定組織中增強與其相連的啟動子的活性l無基因特異性 l遠距離調(diào)節(jié)啟動子以降低轉(zhuǎn)錄效率的一段DNA序列,是調(diào)節(jié)基因表達的順勢作用負調(diào)控元件,最早在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)l為轉(zhuǎn)錄提供終止信號的一段DNA序列,是基因表達的順勢作用負調(diào)控元件.l是原核生物基因表達調(diào)控的精細調(diào)節(jié)裝置,是基因表達的負調(diào)控元件.翻譯是mRNA指導(dǎo)多態(tài)鏈合成的過程,包括多態(tài)鏈合成的起始,延伸和終止過程l翻譯起始對基因表達的影響 原核生物起始密碼子(AUG),SD,

3、SD序列與起始密碼之間的距離保持在93個核苷酸;真核生物的5端帽子結(jié)構(gòu),起始密碼子周邊共有序列,有效的ORF是翻譯所必需l密碼子偏愛的影響l翻譯終止的影響 終止密碼子對翻譯的效率有很大影響. UAA,UAG,UGAl表達載體和受體細胞共同組成了外源基因的表達系統(tǒng).promoterOperatorStructural geneterminatorG1G2G3只有一種只有一種 RNA 聚合酶，識別原核細胞的啟動子，催化聚合酶，識別原核細胞的啟動子，催化所有的所有的RNA合成。合成。以操縱子為單位，數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)以操縱子為單位，數(shù)個相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因與其調(diào)控區(qū)結(jié)合形成一個表達的協(xié)同單位合

4、形成一個表達的協(xié)同單位 轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)、連續(xù)進行。 不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng)不含內(nèi)含子，缺乏轉(zhuǎn)錄后的加工系統(tǒng) 調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平上mRNA的核糖體結(jié)合位點上含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子的核糖體結(jié)合位點上含有一個轉(zhuǎn)譯起始密碼子及同及同16S核糖體核糖體RNA末端互補的序列末端互補的序列,即即Shine-Dalgarno（S-D）sequence mRNA上一段同核糖體上一段同核糖體16S RNA3末端堿基互補的序列，叫末端堿基互補的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列）序列l(wèi)通過表達載體將外源基因?qū)胨拗骶?并指導(dǎo)宿主菌酶系統(tǒng)合成外源

5、蛋白l外源基因不能帶有內(nèi)含子,必須用cDNA或全化學(xué)合成基因l外源基因與表達載體連接后形成正確的開放閱讀框架(open reading frame)。l 必須利用原核細胞的調(diào)控原件（啟動子等）l 防止外源基因產(chǎn)物對宿主細胞的毒害l原核生物基因表達的調(diào)控序列主要涉及啟動子啟動子,S-D序列序列,終止子終止子,衰減子等序列衰減子等序列啟動子啟動子 :是是DNA上的能與上的能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列合成的序列 ,是基因表達不可缺少的序列是基因表達不可缺少的序列.保守序列保守序列 l-1010區(qū)（區(qū)（PribnowPribnow框）也稱框）也稱TATA-box,T

6、ATA-box,TATAATl-3535區(qū)（區(qū)（SextamaSextama框）框）TTGACA,是是RNA聚合酶聚合酶亞亞基的識別與結(jié)合位點基的識別與結(jié)合位點6bpCATTATAATTTGACA1520bp- 10元件元件- 35元件元件-1 +1+30-35 區(qū)序列區(qū)序列-10 區(qū)序列區(qū)序列PrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動子啟動子T T G A C AG A T A C TT T G A T AT A T A A TT T G A C AT T A A C TT A G A C AT A A T G TT T T A C AT A T A A TT T G A C AT A

7、 T A A TPtac = 3 Ptrp = 11 PlacPlLl乳糖啟動子乳糖啟動子lac-來自大腸桿菌的乳糖操縱子來自大腸桿菌的乳糖操縱子l色氨酸啟動子色氨酸啟動子trp-來自大腸桿菌的色氨酸操縱子來自大腸桿菌的色氨酸操縱子lPL和和PR啟動子啟動子 -l l噬菌體中得到的一類啟動子噬菌體中得到的一類啟動子比lac啟動子的活性高8-10倍，比trp啟動子活性高.-10 區(qū)順序:GATAAT,-35區(qū)順序:TGACTAl tac啟動子l由trp 和 lac啟動子人工構(gòu)建的雜合啟動子l位于翻譯起始密碼子（位于翻譯起始密碼子（AUG)AUG)上游上游5-13bp5-13bp處的由處的由3-9

8、個個bpbp組成的核苷酸序列富含嘌組成的核苷酸序列富含嘌呤核苷酸，呤核苷酸， 5 UAAGGAGG 3，它通，它通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16S rRNA 3端區(qū)域端區(qū)域3 AUUCCUCC 5并與之并與之專一性結(jié)合，將專一性結(jié)合，將mRNA定位于核糖體上，定位于核糖體上，從而啟動翻譯；從而啟動翻譯；(1) SD序列的影響序列的影響：一般來說，一般來說，mRNA與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的與核糖體的結(jié)合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于起始效率就越高，而這種結(jié)合程度主要取決于SD序序列與列與16S rRNA的堿基互補性，其中以的堿基互

9、補性，其中以GGAG四個堿四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基中任何一個換成中任何一個換成C或或T，均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降，均會導(dǎo)致翻譯效率大幅度降低低 (2) SD序列與起始密碼子之間的序列的影響序列與起始密碼子之間的序列的影響 SD序列下游的堿基若為序列下游的堿基若為AAAA或或UUUU，翻譯效率最，翻譯效率最高；而高；而CCCC或或GGGG的翻譯效率則分別是最高值的翻譯效率則分別是最高值的的50%和和25%。緊鄰。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響，對于大腸桿菌起始也有影響，對于大腸桿菌b b-半

10、乳糖苷酶的半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或或CUU，如果用，如果用UUC、UCA或或AGG取代之，則酶取代之，則酶的表達水平低的表達水平低20倍倍(3) SD序列與起始密碼子之間的距離的影響序列與起始密碼子之間的距離的影響：SD序列與起始密碼子之間的距離是影響序列與起始密碼子之間的距離是影響mRNAmRNA轉(zhuǎn)譯成轉(zhuǎn)譯成蛋白的主要因素之一。在很多情況下，蛋白的主要因素之一。在很多情況下，SD序列位于序列位于AUG之前大約七個堿基處。在此間隔中少一個堿基之前大約七個堿基處。在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度

11、的或多一個堿基，均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低降低在一個基因的在一個基因的3 3端或是一個操縱子的端或是一個操縱子的3 3端往往有一特定的端往往有一特定的核苷酸序列核苷酸序列, ,有終止轉(zhuǎn)錄的功能有終止轉(zhuǎn)錄的功能, ,這一序列稱為轉(zhuǎn)錄終這一序列稱為轉(zhuǎn)錄終止子止子, ,簡稱終止子簡稱終止子. .轉(zhuǎn)錄終止過程包括轉(zhuǎn)錄終止過程包括: :lDNADNA聚合酶停留在聚合酶停留在DNADNA模板上不再前進，模板上不再前進，RNARNA的延伸停止；的延伸停止；l完成轉(zhuǎn)錄的完成轉(zhuǎn)錄的RNARNA從從RNARNA聚合酶上釋放出來；聚合酶上釋放出來；lRNARNA聚合酶從模板上釋放出來。聚合酶從模板上釋放出來

12、。l特點特點: :有一段富含有一段富含A/TA/T的區(qū)域和一段富含的區(qū)域和一段富含G/CG/C的區(qū)域的區(qū)域,G/C,G/C區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu)區(qū)域又具有回文對稱結(jié)構(gòu), ,轉(zhuǎn)錄后形成的轉(zhuǎn)錄后形成的RNARNA具有莖環(huán)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu), ,并且有與并且有與A/TA/T富含區(qū)對應(yīng)的一串富含區(qū)對應(yīng)的一串U.U.l內(nèi)在終止子內(nèi)在終止子（intrinsic terminator)l依賴依賴因子的終止子因子的終止子 (- dependent terminator ）l指在某些前導(dǎo)序列中帶有控制蛋白質(zhì)合成速率的調(diào)節(jié)區(qū)。能夠與mRNA作用形成獨特的結(jié)構(gòu)，終止轉(zhuǎn)錄。lAmp, Tet, St 等 lpkk233

13、-3:pkk233-3:非融合型表達蛋白載體；非融合型表達蛋白載體；lPIN III: PIN III: 分泌型克隆表達載體；分泌型克隆表達載體；1.1.pGEX:pGEX:融合蛋白表達載體。融合蛋白表達載體。l載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌載體表達出的外源基因蛋白質(zhì)不與細菌的任何蛋白質(zhì)融合在一起的任何蛋白質(zhì)融合在一起優(yōu)點優(yōu)點:產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白產(chǎn)物結(jié)構(gòu)接近于真核細胞體內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)質(zhì)結(jié)構(gòu),其表達產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更其表達產(chǎn)物的生物學(xué)功能也就更接近生物體內(nèi)天然蛋白接近生物體內(nèi)天然蛋白缺點缺點:容易被細菌蛋白酶所破壞容易被細菌蛋白酶所破壞.如如pKK223-3 載體載體 S-

14、DP結(jié)構(gòu)基因TAGl 強啟動子: tac（trp-lac）l操縱基因：乳糖操縱子系統(tǒng)。l調(diào)節(jié)基因：宿主菌染色體上的乳糖操縱子系統(tǒng)，如JM105l終止子：rrnB核糖體RNA的強終止子lS-D序列和插入位點區(qū)l載體的其余部分：來自pBR322質(zhì)粒l表達誘導(dǎo)物IPTG（乳糖的類似物，不會被降解）必須選擇一個有必須選擇一個有l(wèi)acI的宿主菌的宿主菌 l除了在細胞內(nèi)表達外，還可讓表達的蛋白分泌到細胞外或細胞周質(zhì)區(qū)中。這種表達方式可避免細胞內(nèi)蛋白酶的降解，或使表達的蛋白正確折疊，或去除 N- 末端的甲硫氨酸，從而達到維護目標(biāo)蛋白活性的目的。l載體表達出的外源蛋白質(zhì)與細菌的分泌信號肽連在一起。l 強啟動子

15、：Ipp（脂蛋白基因啟動子）和lacUV5啟動子l調(diào)節(jié)基因：lac IlS-D序列和起始密碼ATGl分泌信號肽l大腸桿菌外膜蛋白基因ompal插入位點區(qū)（多克隆位點）。lIpp-lac-lacO-S-D/ATGompa-插入位點lpIN III-comA1l以pBR322為基礎(chǔ)構(gòu)建的l調(diào)節(jié)基因不必借助于宿主的lacI.分泌型表達載體分泌型表達載體-pINIII-ompA1lacl表達出的外源基因產(chǎn)物蛋白是與質(zhì)粒載體上的菌體蛋白連接在一起的。 優(yōu)點：優(yōu)點：u可誘導(dǎo)高效表達可誘導(dǎo)高效表達u載體內(nèi)含有載體內(nèi)含有l(wèi)acI阻遏蛋白基因阻遏蛋白基因u融合蛋白的分離和純化方便融合蛋白的分離和純化方便u使用凝

16、血酶和使用凝血酶和Xa因子可以從表達的融合蛋白中切下因子可以從表達的融合蛋白中切下所需的蛋白質(zhì)和多肽所需的蛋白質(zhì)和多肽u用用EcoRI從從rgt11載體中分離的基因可直接插入載體中分離的基因可直接插入Pgex-1rT中中PSDForeign DNA融合型表達載體融合型表達載體融合基因融合基因啟動子：tac 操縱基因：lacO，調(diào)節(jié)基因：lacIS-D序列，ori：pBR322 ori，S-D下游融合肽：GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）lacI-Ptac-lacO-S-D/ATG-GST-基因插入位點-TGAl選擇強啟動子序列，如選擇強啟動子序列，如tac 等等l調(diào)整調(diào)整S-D序列與序列與AUG堿的

17、距離，一般為堿的距離，一般為5-9bp l改變起始密碼下面的幾組密碼子改變起始密碼下面的幾組密碼子 l增加增加mRNA的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性的拷貝數(shù)和穩(wěn)定性l 減輕宿主細胞的代謝負荷減輕宿主細胞的代謝負荷l提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性 常用的方法有:l誘導(dǎo)表達:使細菌的生長與外源基因的表達分開.一般用溫度或藥物誘導(dǎo)l表達載體的誘導(dǎo)復(fù)制:將宿主菌的生長和表達質(zhì)粒的復(fù)制分開 (1)克隆一段原核序列,表達融合蛋白融合蛋白:指表達的蛋白質(zhì)或多肽N端由原核DNA編碼,C末端由克隆的真核DNA的完整序列編碼,這樣表達的蛋白是由一條短的原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起,稱為融合蛋白.去除原核蛋白的方法由:

18、化學(xué)降解法和酶降解法.(2)采用某種突變菌株,保護表達蛋白不被降解.如次黃嘌呤核苷缺陷型菌株做受體菌,使蛋白酶合成受阻.(3)表達分泌蛋白大腸桿菌主要由4部分組成:胞質(zhì),內(nèi)膜,外膜及內(nèi)外膜之間的周間質(zhì).分泌是指蛋白質(zhì)從胞質(zhì)跨過內(nèi)膜進入周間質(zhì)這一過程.l蛋白質(zhì)在大腸桿菌中進行分泌必須具備的條件是:有一段信號肽;在成熟蛋白質(zhì)內(nèi)有適當(dāng)?shù)呐c分泌相關(guān)的氨基酸序列;細胞內(nèi)具有相應(yīng)的轉(zhuǎn)運機制.l信號肽:信號肽序列對于分泌蛋白質(zhì)是必需的.長度一般為15-30個氨基酸,特點:(a)在氨基末端有一段帶正點荷的氨基酸序列,往往是精氨酸或賴氨酸殘基,數(shù)目為1-3個;(b)有一個疏水的核心區(qū),含亮氨酸或異亮氨酸殘基,位

19、置可以從帶正點荷的氨基酸延伸到含切割位點的區(qū)域;(c) 含有能被信號肽酶水解的切割位點,這個位點常在丙氨酸之后或甘氨酸,絲氨酸之后.真核細胞做宿主表達系統(tǒng)的優(yōu)點真核細胞做宿主表達系統(tǒng)的優(yōu)點能夠識別和除去外源基因中的內(nèi)含子能夠識別和除去外源基因中的內(nèi)含子,剪接加工形成成剪接加工形成成熟的熟的mRNA,包括包括5端加帽和端加帽和3-端加尾端加尾真核細胞將表達的蛋白質(zhì)糖基化真核細胞將表達的蛋白質(zhì)糖基化缺點缺點:選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)只有少數(shù)幾個選擇標(biāo)記及選擇系統(tǒng)只有少數(shù)幾個轉(zhuǎn)化效率低轉(zhuǎn)化效率低,只有只有10-610-4外源基因轉(zhuǎn)移并整合到細胞染色體外源基因轉(zhuǎn)移并整合到細胞染色體DNA上帶有一定的上帶有一

20、定的自發(fā)性和盲目性自發(fā)性和盲目性,整合的拷貝數(shù)和位置還不能控制整合的拷貝數(shù)和位置還不能控制細胞培養(yǎng)和細胞挑選的要求比較高細胞培養(yǎng)和細胞挑選的要求比較高l原核DNA序列l(wèi)啟動子l增強子l剪接信號l轉(zhuǎn)錄終止信號lPoly(A)加尾信號l真核生物的表達載體基本上都是在原核細胞和真核細胞之間的穿梭載體.能在大腸桿菌中自身復(fù)制的復(fù)制子及便于篩選含重組細菌的抗生素抗性基因和多克隆位點根據(jù)啟動子功能和作用方式的不同，真核生物啟動子分為：組成型啟動子:在所有組織中都能持續(xù)啟動基因的表達，表達產(chǎn)物量相對恒定。組織特異性啟動子：在組織特異性啟動子調(diào)控下的基因轉(zhuǎn)錄一般只發(fā)生在某些特定器官中，往往表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性

21、 誘導(dǎo)型啟動子：該類啟動子在某些特定的物理、化學(xué)或生物刺激下，可以大幅度提高基因的轉(zhuǎn)錄水平。優(yōu)點：根據(jù)需要在受體特定的發(fā)育階段，組織或生長環(huán)境下，讓其接受誘導(dǎo)信號，誘導(dǎo)目的基因的表達。如植物的光誘導(dǎo)啟動子，熱誘導(dǎo)啟動子等。一個理想的可誘導(dǎo)表達系統(tǒng)要求：特異性；可誘導(dǎo)性；非干擾性;雜合啟動子l啟動子和增強子聯(lián)合應(yīng)用可大大提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平。l不同來源的終止子對外源基因的表達有很大影響，不僅決定外源基因的轉(zhuǎn)錄活性，也決定mRNA在細胞中的穩(wěn)定性，從而影響mRNA的翻譯。l內(nèi)含子可通過增加活性mRNA含量水平來促進基因的表達 將蓖麻的過氧化氫酶基因的啟動子插入到GUS后，可以使GUS的表達活性在

22、水稻細胞中提高90倍。 對植物轉(zhuǎn)基因研究表明，內(nèi)含子對基因表達的增強作用主要發(fā)生在單子葉植物。轉(zhuǎn)基因動物的基因組DNA比cDNA表達水平高。mRNA3末端的polyA尾可防止外切核酸酶對mRNA3末端的降解，增加mRNA穩(wěn)定性。加尾信號需要3部分：l多聚腺苷酸化序列：AAUAAA;l剪切位點和加尾位點YA；l下游保守序列，如U-rich.7 選擇標(biāo)記基因和報告基因l是表達載體的重要組成元件，通常編碼一種正常細胞中不存在的酶，對轉(zhuǎn)化細胞的生長和分化不發(fā)生影響。胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因 二氫葉酸還原酶基因（DHFR） 新霉素抗性基因（neor） 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（C

23、AT）chloramphenicol acetyl transferase次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶基因(hgpt)營養(yǎng)缺陷型的互補基因營養(yǎng)缺陷型的互補基因用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補基因和用于酵母菌轉(zhuǎn)化子篩選的標(biāo)記基因主要有營養(yǎng)缺陷型互補基因和顯性基因兩大類顯性基因兩大類營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基營養(yǎng)缺陷型互補基因主要有氨基酸和核苷酸生物合成基因，如：因，如： LEU、TRP、HIS、LYS、URA、ADE但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難但對于多倍體酵母來說，篩選營養(yǎng)缺陷型的受體非常困難l潮霉素(hpt)l卡那霉素(kana)l新霉素抗性基因(neor)l博萊霉素 Zeocin 起報告和識別作用，它的表達產(chǎn)物對受體細胞無毒性，可反映外源基因在受體細胞中的表達水平。大腸桿菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶（-D-glucuronidase，GUS）；細菌和螢火蟲的熒光素酶（luciferase）；水母綠色熒光蛋白（GFP）基因（Green Fluorescent Protein）其它lGFP在紫外光照下發(fā)綠色熒光在紫外光照下發(fā)綠色熒光l