生物化學(xué)主講：第十一章核酸代謝

1、生物化學(xué)主講：第十一章核酸代謝2（一）（一）DNA的半保留復(fù)制（的半保留復(fù)制（semicoservative replication） 在復(fù)制過程中首先堿基間氫在復(fù)制過程中首先堿基間氫鍵需斷裂并使雙鏈解旋和分鍵需斷裂并使雙鏈解旋和分開，然后每條單鏈可作模板開，然后每條單鏈可作模板在其上合成新的互補(bǔ)鏈，形在其上合成新的互補(bǔ)鏈，形成成2個個DNA互補(bǔ)雙鏈。新形成互補(bǔ)雙鏈。新形成的兩個的兩個DNA分子與原分子與原DNA分分子的堿基順序完全一樣。每子的堿基順序完全一樣。每個子代分子的一條鏈來自親個子代分子的一條鏈來自親代代DNA，另一條鏈?zhǔn)切潞铣闪硪粭l鏈?zhǔn)切潞铣傻牡?DNA的這種復(fù)制方式稱為的這種復(fù)制

2、方式稱為 。3（二）參與（二）參與DNA復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì)復(fù)制有關(guān)的酶和蛋白質(zhì) 1. DNA聚合酶（聚合酶（DNA Polymerase） 參與參與DNA復(fù)制的酶：復(fù)制的酶：DNA聚合酶、聚合酶、DNA連接酶、連接酶、旋轉(zhuǎn)酶、解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、引發(fā)酶及一些蛋旋轉(zhuǎn)酶、解旋酶、單鏈結(jié)合蛋白、引發(fā)酶及一些蛋白質(zhì)因子等。白質(zhì)因子等。是催化以脫氧核苷三磷酸（是催化以脫氧核苷三磷酸（dNTP）為底為底物（物（substrate）合成合成DNA的一類酶。的一類酶。原核細(xì)胞和真核細(xì)胞原核細(xì)胞和真核細(xì)胞DNA聚合酶的種類和作用有所不聚合酶的種類和作用有所不同同 。DNA聚合酶催化的反應(yīng)：聚合酶催化的反應(yīng)：

3、 ndATP ndGTP ndCTP ndTTP模板（模板（DNA），），引物（引物（RNA，DNA）DNA聚合酶聚合酶DNA 4nPPi4DNA聚合酶的作用機(jī)理聚合酶的作用機(jī)理 5在大腸桿菌中至少發(fā)現(xiàn)了五種在大腸桿菌中至少發(fā)現(xiàn)了五種DNA 聚合酶，分別聚合酶，分別是是DNA 聚合酶聚合酶 I、II、III、IV和和V，其中聚合酶其中聚合酶 I發(fā)現(xiàn)最早（發(fā)現(xiàn)最早（1956年），而聚合酶年），而聚合酶IV和和V到到1999年年才發(fā)現(xiàn)。才發(fā)現(xiàn)。 （1）原核細(xì)胞）原核細(xì)胞DNA聚合酶聚合酶 DNA polymerase I（pol I）：）：1956年年Kornberg等在等在Ecoli中發(fā)現(xiàn)的第中

4、發(fā)現(xiàn)的第一個一個DNA聚合酶，是聚合酶，是DNA復(fù)制研復(fù)制研究中的重要里程碑，究中的重要里程碑， Kornberg因因此獲得此獲得1959年諾貝爾化學(xué)獎。年諾貝爾化學(xué)獎。 6 DNA pol I 也稱也稱Kornberg酶酶, Mr 103 Kd, 一條一條多肽鏈多肽鏈,一個鋅原子（活性所必需），每個細(xì)胞一個鋅原子（活性所必需），每個細(xì)胞內(nèi)大約有內(nèi)大約有400個分子的個分子的pol I。 53聚合作用聚合作用 35核酸外切酶的活性核酸外切酶的活性 53核酸外切酶的活性核酸外切酶的活性 焦磷酸解作用焦磷酸解作用 焦磷酸基交換的作用焦磷酸基交換的作用 因此因此DNA pol I屬于多功能酶屬于多功

5、能酶功能：功能：53聚合作用：聚合作用： DNA pol I 不能不能“從從無到有無到有”進(jìn)行合成，只能進(jìn)行合成，只能從已有的多核苷酸鏈的從已有的多核苷酸鏈的3-OH端延長端延長DNA鏈，即必鏈，即必須要有引物須要有引物（ Primer ）, 引物多為引物多為RNA，少數(shù)情況少數(shù)情況下是下是DNA，引物必需具有引物必需具有游離的游離的3-OH。 7單鏈線狀單鏈線狀DNA單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀DNAB. 局部變成了單鏈局部變成了單鏈 的雙鏈的雙鏈DNAD.有缺口（有缺口（gap）的雙鏈的雙鏈DNA模板引物模板引物53 53 A.單鏈單鏈DNA5 3 3 3 5 缺口填充缺口填充3 3 C. 有切口（有

6、切口（nick）的雙的雙鏈鏈DNA模板：模板：注意：完整的雙鏈注意：完整的雙鏈DNA不能作模板。不能作模板。8 Pol II是由一條是由一條Mr為為88Kd的多肽鏈組成，它的活的多肽鏈組成，它的活性約為性約為pol I的的5%，也要模板和帶，也要模板和帶3-OH末端的引物，末端的引物，最好的模板是有最好的模板是有g(shù)ap的雙鏈的雙鏈DNA，有有35核酸外切核酸外切酶的活性，無酶的活性，無53核酸外切酶的活性，主要用于核酸外切酶的活性，主要用于DNA的修復(fù)。的修復(fù)。 DNA Polymerase II（DNA pol II）：）：1970年和年和1971年先后分離出年先后分離出pol II和和po

7、l III。9 是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物是由多種蛋白質(zhì)組成的復(fù)合物, Mr 高達(dá)高達(dá)900Kd。 每個約含每個約含10分子分子DNA pol III，雖然量很少，雖然量很少，但活性很強(qiáng)，為但活性很強(qiáng)，為pol I的的15倍，模板和倍，模板和pol II大致大致相同，有相同，有35核酸外切酶的活性，但無核酸外切酶的活性，但無53核核酸外切酶的活性，酸外切酶的活性，DNA pol III是原核細(xì)胞是原核細(xì)胞DNA復(fù)復(fù)制的主要酶。這個酶的缺陷株往往是致死的。制的主要酶。這個酶的缺陷株往往是致死的。 DNA polymerase III(DNA pol III)：10 DNA polymerase

8、IV和和V（DNA pol IV和和V）：）： 1999年才被發(fā)現(xiàn)，涉及年才被發(fā)現(xiàn)，涉及DNA的錯誤傾向修復(fù)，當(dāng)?shù)腻e誤傾向修復(fù)，當(dāng)DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷時，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩種酶。但修受到嚴(yán)重?fù)p傷時，即可誘導(dǎo)產(chǎn)生這兩種酶。但修復(fù)缺乏準(zhǔn)確性，因而出現(xiàn)高的突變率。復(fù)缺乏準(zhǔn)確性，因而出現(xiàn)高的突變率。11大腸桿菌三種大腸桿菌三種DNA聚合酶的比較聚合酶的比較pol Ipol IIpol III分子量分子量103Kd88Kd900Kd不同種類亞基數(shù)目不同種類亞基數(shù)目1 7 10每個細(xì)胞的分子數(shù)每個細(xì)胞的分子數(shù)40010010生物學(xué)活性生物學(xué)活性10.051553聚合酶活性聚合酶活性35外切酶活性外切酶活性53

9、外切酶活性外切酶活性功能功能 校正，修復(fù)，校正，修復(fù)，去除去除RNA引物引物修復(fù)修復(fù)復(fù)制（復(fù)制（53聚合作用）聚合作用）12 有有DNA pol.、5種，種， pol 存在存在于線粒體內(nèi)，其余存在于細(xì)胞核中。主要區(qū)別于線粒體內(nèi)，其余存在于細(xì)胞核中。主要區(qū)別是動力學(xué)性質(zhì)和對抑制劑的敏感性不同。其他是動力學(xué)性質(zhì)和對抑制劑的敏感性不同。其他性質(zhì)基本上同性質(zhì)基本上同E. coli的聚合酶，即：需要模板的聚合酶，即：需要模板, 帶帶3-OH的引物和的引物和4種脫氧核苷三磷酸，鏈的延種脫氧核苷三磷酸，鏈的延伸方向?yàn)樯旆较驗(yàn)?3。 （2）真核生物）真核生物DNA 聚合酶聚合酶13哺乳動物哺乳動物DNA聚合酶

10、聚合酶定位定位細(xì)胞細(xì)胞核核細(xì)胞細(xì)胞核核線粒線粒體體細(xì)胞細(xì)胞核核細(xì)胞細(xì)胞核核聚合方向：聚合方向：53 外切酶活性外切酶活性35功能功能引物引物 合成合成修復(fù)修復(fù)線粒線粒體體DNA合成合成核核DNA 合成合成修復(fù)修復(fù)142. DNA 連接酶（連接酶（DNA ligase） 催化雙鏈催化雙鏈DNA切口的切口的5 磷酸磷酸基和基和3羥基生成磷酸二酯鍵。羥基生成磷酸二酯鍵。連接酶催化連接酶催化DNA復(fù)制過程最復(fù)制過程最后的反應(yīng)。后的反應(yīng)。 連接反應(yīng)需要能量。連接反應(yīng)需要能量。E.coli 和其他細(xì)菌的和其他細(xì)菌的DNA連接連接酶以酶以NAD為能源，動物為能源，動物細(xì)胞和噬菌體的連接酶以細(xì)胞和噬菌體的連接

11、酶以ATP為能源。為能源。15 此酶首先在中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時稱此酶首先在中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時稱-蛋白，后蛋白，后來在真核生物中也發(fā)現(xiàn)了類似活性的酶，真核來在真核生物中也發(fā)現(xiàn)了類似活性的酶，真核生物中的這類酶有多個名稱：生物中的這類酶有多個名稱：nicking-closing enzyme （切口開合酶，切口閉合酶等），切口開合酶，切口閉合酶等），untwisting enzyme（解纏酶）。解纏酶）。 （1）拓?fù)洚悩?gòu)酶）拓?fù)洚悩?gòu)酶I（ topoisomerase I，Top I；旋轉(zhuǎn)酶旋轉(zhuǎn)酶I ） 該酶的功能：切開超螺旋雙鏈該酶的功能：切開超螺旋雙鏈DNA中的一條中的一條鏈，鏈的切口末端就可轉(zhuǎn)動，使鏈，鏈的

12、切口末端就可轉(zhuǎn)動，使DNA變成松馳狀變成松馳狀態(tài)，然后再將切口封閉，此酶作用時不消耗態(tài)，然后再將切口封閉，此酶作用時不消耗ATP。 3. 使使DNA雙螺旋解開所需的酶或蛋白質(zhì)雙螺旋解開所需的酶或蛋白質(zhì) 16 它的功能也是使超螺旋松馳。在消耗它的功能也是使超螺旋松馳。在消耗ATP的情的情況下，能將復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋變成負(fù)超況下，能將復(fù)制叉前方產(chǎn)生的正超螺旋變成負(fù)超螺旋。在無螺旋。在無ATP時，可同時切開超螺旋的兩條鏈，時，可同時切開超螺旋的兩條鏈，使使DNA變成松馳狀態(tài)，然后將切口封接好，克服變成松馳狀態(tài)，然后將切口封接好，克服解鏈過程中在復(fù)制叉前方造成的解鏈過程中在復(fù)制叉前方造成的“打結(jié)

13、打結(jié)”現(xiàn)象?，F(xiàn)象。 （2）topoisomerase II（拓?fù)洚悩?gòu)酶拓?fù)洚悩?gòu)酶II，Top II；旋轉(zhuǎn)酶旋轉(zhuǎn)酶II ） 這酶首先也是在中發(fā)現(xiàn)。這酶首先也是在中發(fā)現(xiàn)。17（3） DNA 解螺旋酶解螺旋酶（ DNA helicase ，又稱，又稱DNA解鏈酶）解鏈酶） 通過水解通過水解ATP獲得能量獲得能量, 使雙螺旋使雙螺旋DNA兩條鏈分開。兩條鏈分開。 目前已知含有目前已知含有4種解螺旋酶種解螺旋酶:解螺旋酶解螺旋酶I、II、III和和Rep蛋白，其中蛋白，其中Rep蛋白是中最蛋白是中最主要的解螺旋酶，每解開一對互補(bǔ)堿基的主要的解螺旋酶，每解開一對互補(bǔ)堿基的氫鍵需水解氫鍵需水解2分子分子AT

14、P。18 功能：與解開雙螺旋后的單鏈功能：與解開雙螺旋后的單鏈DNA結(jié)合，防止單鏈結(jié)合，防止單鏈DNA重新形成雙螺旋或重新形成雙螺旋或被核酸酶降解。被核酸酶降解。（4）單鏈結(jié)合蛋白）單鏈結(jié)合蛋白（ Single-strand binding proteins，SSB）19（三）原核生物（三）原核生物DNA的復(fù)制過程的復(fù)制過程 1. DNA復(fù)制的起點(diǎn)和方向復(fù)制的起點(diǎn)和方向 原核生物：原核生物：1個起點(diǎn)（個起點(diǎn)（origin of replication，復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制原點(diǎn)）。復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制原點(diǎn)）。 復(fù)制起點(diǎn)核苷酸序列的特復(fù)制起點(diǎn)核苷酸序列的特征征: （1）堿基序列高度保守。）堿基序列高度保守。（

15、2）富含）富含AT，利于利于DNA解鏈。解鏈。方向方向: 多為雙向復(fù)制。多為雙向復(fù)制。20染色體環(huán)狀染色體環(huán)狀DNA的的復(fù)制復(fù)制: 一個復(fù)制起點(diǎn)，雙向一個復(fù)制起點(diǎn)，雙向展開，形成展開，形成狀中間物，直至兩個復(fù)制叉相遇，狀中間物，直至兩個復(fù)制叉相遇，稱為稱為復(fù)制。復(fù)制。 21 復(fù)制子復(fù)制子: 受同一個復(fù)制起始區(qū)控制的受同一個復(fù)制起始區(qū)控制的DNA稱為復(fù)制子（稱為復(fù)制子（replicon），），它是復(fù)制的功能單位。它是復(fù)制的功能單位。 原核細(xì)胞只有一個復(fù)制子。通常細(xì)菌、病原核細(xì)胞只有一個復(fù)制子。通常細(xì)菌、病毒和線粒體的毒和線粒體的DNA分子都是以單復(fù)制子完成復(fù)分子都是以單復(fù)制子完成復(fù)制的。制的。

16、真核生物：有很多復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制方向也真核生物：有很多復(fù)制起點(diǎn)，復(fù)制方向也是雙向。真核細(xì)胞的細(xì)胞核是雙向。真核細(xì)胞的細(xì)胞核DNA復(fù)制包含多個復(fù)制包含多個復(fù)制子。復(fù)制子。 22起點(diǎn)起點(diǎn) 起點(diǎn)起點(diǎn)+復(fù)制眼復(fù)制眼真核細(xì)胞的多個復(fù)制子真核細(xì)胞的多個復(fù)制子23在復(fù)制的起始點(diǎn)處，在復(fù)制的起始點(diǎn)處，DNA雙鏈部分解開為單鏈，形雙鏈部分解開為單鏈，形成叉子形狀稱復(fù)制叉（成叉子形狀稱復(fù)制叉（replication fork）。）。242. DNA的半不連續(xù)復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制（semi-discontinuous replication）25 所有的所有的DNA聚合酶的合成方向都是聚合酶的合成方向都是53。1968

17、年日本學(xué)者年日本學(xué)者Okazaki岡崎提出了岡崎提出了DNA的不連續(xù)的不連續(xù)復(fù)制模型：復(fù)制模型：35向的向的DNA鏈合成不是連續(xù)的，由鏈合成不是連續(xù)的，由許多許多53方向合成的方向合成的DNA片段連接起來，不連續(xù)片段連接起來，不連續(xù)的的DNA片段稱為岡崎片段（片段稱為岡崎片段（Okazaki fragment）。）。 由于由于35向的向的DNA鏈的合成不連續(xù)，鏈的合成不連續(xù)，53向向的的DNA鏈合成是連續(xù)的，因此稱半不連續(xù)復(fù)制鏈合成是連續(xù)的，因此稱半不連續(xù)復(fù)制。 26 在在DNA復(fù)制時，以復(fù)制時，以35方向?yàn)槟０搴铣傻囊环较驗(yàn)槟０搴铣傻囊粭l新鏈?zhǔn)沁B續(xù)的條新鏈?zhǔn)沁B續(xù)的,稱前導(dǎo)鏈（稱前導(dǎo)鏈（lea

18、ding strand），），它它的延伸方向與復(fù)制叉的移動方向相同。另一條新鏈的延伸方向與復(fù)制叉的移動方向相同。另一條新鏈的合成是不連續(xù)的，由許多的合成是不連續(xù)的，由許多53方向的岡崎片段方向的岡崎片段組成，這條新鏈稱組成，這條新鏈稱后隨鏈后隨鏈 （lagging strand），），它它的延伸方向與復(fù)制叉的移動方向相反。的延伸方向與復(fù)制叉的移動方向相反。 27 DNA聚合酶不能聚合酶不能“從無到有從無到有”地合成多核地合成多核苷酸鏈，只能從已有的多核苷酸鏈上延長，已苷酸鏈，只能從已有的多核苷酸鏈上延長，已有的多核苷酸鏈?zhǔn)怯械亩嗪塑账徭準(zhǔn)?，引物多為，引物多為RNA，也可也可以是已有的以是已有的

19、DNA片段。片段。 3. DNA的合成需要以的合成需要以RNA為引物為引物28 以單鏈以單鏈DNA為模板，沿為模板，沿53方向合成小分子方向合成小分子RNA引物，在大腸桿菌中引物，在大腸桿菌中RNA引物（引物（RNA primer）由引發(fā)酶（由引發(fā)酶（primase）催化，引物的長度催化，引物的長度160個核苷個核苷酸（引物的長度取決于物種）。酸（引物的長度取決于物種）。 29合成合成RNA引物的過程稱引發(fā)，引發(fā)是一個十引物的過程稱引發(fā)，引發(fā)是一個十分復(fù)雜的過程分復(fù)雜的過程。 4. 引發(fā)（引發(fā)（ priming） DNA合成的起始合成的起始 305. DNA復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)和鏈的延長復(fù)制叉的結(jié)構(gòu)和

20、鏈的延長 DNA復(fù)制時，復(fù)制時，DNA雙螺旋的解開靠雙螺旋的解開靠helicase（解螺旋酶）、解螺旋酶）、SSB 、 Top II, 在在RNA引物合成后，引物合成后，DNA pol III與復(fù)制叉結(jié)合，形成與復(fù)制叉結(jié)合，形成復(fù)制體（復(fù)制體（replisome）的結(jié)構(gòu)，而啟動的結(jié)構(gòu)，而啟動DNA的的合成。合成。 復(fù)制體為多分子復(fù)合物，由復(fù)制體為多分子復(fù)合物，由DNA pol III與與其他酶和蛋白質(zhì)組成，組裝于細(xì)菌染色體的復(fù)其他酶和蛋白質(zhì)組成，組裝于細(xì)菌染色體的復(fù)制叉。制叉。 31 復(fù)制起點(diǎn)解開后形成復(fù)制起點(diǎn)解開后形成2個復(fù)制叉，進(jìn)行雙向復(fù)制，個復(fù)制叉，進(jìn)行雙向復(fù)制，前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成都需

21、要前導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成都需要RNA引物，前導(dǎo)鏈先由引物，前導(dǎo)鏈先由引發(fā)酶在起點(diǎn)處合成一段引發(fā)酶在起點(diǎn)處合成一段RNA引物，隨后引物，隨后DNA pol III即在引物上添加脫氧核苷酸。前導(dǎo)鏈的合成與復(fù)制叉即在引物上添加脫氧核苷酸。前導(dǎo)鏈的合成與復(fù)制叉的移動保持同步。的移動保持同步。 32滯后鏈的合成是分段進(jìn)行的，需要不斷合成岡崎片段的滯后鏈的合成是分段進(jìn)行的，需要不斷合成岡崎片段的引物引物RNA，然后由，然后由DNA pol III添加脫氧核苷酸。添加脫氧核苷酸。 336鏈的終止鏈的終止 （1）除去引物：）除去引物：DNA pol I以以53核酸外切酶的活性，除去核酸外切酶的活性，除去RNA引物，余下的缺口（引物，余下的缺口（gap）由由DNA pol I按照模板將缺口填按照模板將缺口填滿。滿。 （2）DNA連接酶將最后相鄰的連接酶將最后相鄰的兩個核苷酸的磷酸二酯鍵連接成兩個核苷酸的磷酸二酯鍵連接成為大分子為大分子DNA，再形成一定的再形成一定的空間結(jié)構(gòu)。空間結(jié)構(gòu)。34二、反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄，二、反轉(zhuǎn)錄（逆轉(zhuǎn)錄，reverse transcription） 1970年有人從致癌年有人從致癌RNA病毒中發(fā)現(xiàn)了依賴于病毒中發(fā)現(xiàn)了依賴于RNA的的DNA聚合酶（聚合酶（RNA-de