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文檔簡介
1、1質粒轉化質粒轉化大腸桿菌大腸桿菌21、重組質粒的鑒定 當質粒的重組或其他載體重組后,通常會發(fā)生質粒的重組失敗,包括質粒的本身環(huán)化。因而要求進行篩選,把重組成功的質粒找出來。 在目前常用的質粒和其他載體中含有相應的抗生素抗性基因,若重組成功,或不含質粒的自身環(huán)化,抗生素抗性基因表達,被轉化的大腸桿菌便具備抵抗相應抗生素的能力,可以在含該抗生素的培養(yǎng)基上生長傳代。若重組失敗,大腸桿菌便不能抵抗該抗生素而死亡。2、為擴增質粒和其他載體作準備 由于大腸桿菌繁殖快,在適宜的條件下繁殖一代僅需要20-30min,而且常用質粒可以在大腸桿菌中增殖達到幾百個拷貝。因此,通過對轉化成功的大腸桿菌培養(yǎng),可以在短
2、時間內極大的擴增目的質粒。一、實驗一、實驗目的目的3二、實驗原理二、實驗原理 通過CaCl2對特定的大腸桿菌處理,制備感受態(tài)的細菌。這些細菌可使每微克超螺旋質粒DNA,如一些插入目的DNA片段的重組質粒,產(chǎn)生51062107個轉化的菌落。 當質粒與這些大腸桿菌混合后,質粒粘附在大腸桿菌的表面,在42時,大腸桿菌出現(xiàn)熱休克,質??赏ㄟ^大腸桿菌細胞膜上形成的空隙進入菌體內。隨后,加入LB培養(yǎng)液,于37振動培養(yǎng)可使細菌復蘇,并且表達質粒編碼的抗生素抗性基因,提高轉化效率。轉化成功的大腸桿菌可以在相應抗生素培養(yǎng)皿中傳代,形成菌落。4三、實驗流程:三、實驗流程:滅活滅活物物/ /質粒質粒轉化大腸桿菌轉化
3、大腸桿菌挑菌挑菌搖菌搖菌菌液菌液PCRPCR5四、實驗方法四、實驗方法-凍融法凍融法連接產(chǎn)物滅活連接產(chǎn)物滅活7 700,10min10min(冰上解凍)大腸桿菌感受態(tài)細胞(冰上解凍)大腸桿菌感受態(tài)細胞5 50 0l l、滅火物滅火物1010l l混合物,冰上放置混合物,冰上放置3 30min0min42,42,9 90sec0sec冰上冰上2min2min加入加入10001000ulLBulLB液體(無抗)液體(無抗)3737,振蕩,振蕩1h1h離心離心10000rpm,1min,RT10000rpm,1min,RT去上清去上清800800l l留下留下200200l l上清于上清于1.5ul
4、1.5ul離心管中重懸離心管中重懸涂板涂板3737恒溫箱,倒置培養(yǎng)恒溫箱,倒置培養(yǎng)12h(12h(時間不得超過時間不得超過20h)20h)61、無菌落,失敗,或培養(yǎng)條件不充分。2、菌落布滿如苔樣,失敗,可能是抗生素濃度不夠或失效。3、菌落布滿,抗生素濃度太高,失敗。4、出現(xiàn)菌落,符合要求。(1)(2)(3)(4)7五、結果分析和失敗原因五、結果分析和失敗原因(1)有菌落,說明轉化成功,但有兩種可能性:其一,質粒自身環(huán)化;其二,重組成功。(2)無菌落,說明實驗沒成功。(3)菌落布滿如苔樣,可能是抗生素濃度不夠或失效。(4)出現(xiàn)大菌斑,大多數(shù)是霉菌污染所致。1 1、結果分析、結果分析81、平板中的
5、抗生素部分失效,長出的克隆是雜菌。2、倒Ka平板時,培養(yǎng)基太燙,應冷卻到50以下加Ka抗生素。2、涂板時來回用力過大,涂布環(huán)或者涂布棒灼燒過熱,或不待冷卻就涂布。3、感受態(tài)細胞長時間處在常溫狀態(tài),會嚴重影響其轉化,操作時動作迅速。4、操作時動作過于劇烈,減少對細胞的機械損傷。切記感受態(tài)細胞比較嬌嫩。5、操作過程不規(guī)范,染菌。2 2、轉化失敗的原因、轉化失敗的原因9六、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備六、大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備(1 1)從從LBLB平板上挑取新活化的平板上挑取新活化的E.coliE.coli TOP10TOP10單菌落單菌落于于50ml LB50ml LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中,3737振
6、蕩過夜;振蕩過夜;(2 2)將該菌懸液以)將該菌懸液以1:100-1:501:100-1:50的比例接種于的比例接種于100ml LB100ml LB液體培養(yǎng)基中,液體培養(yǎng)基中,3737振蕩培養(yǎng)振蕩培養(yǎng)2-32-3小時至小時至OD600OD6000.50.5左右;左右;(3 3)將培養(yǎng)液轉入離心管中,冰上放置)將培養(yǎng)液轉入離心管中,冰上放置1010分鐘,然后于分鐘,然后于44下下4100rpm4100rpm離離心心1010min。(4 4)棄掉上清)棄掉上清, ,加入加入3 30ml0.1mol/L預冷的預冷的CaClCaCl2 2 溶液,重懸,冰上放置溶液,重懸,冰上放置15-30min15
7、-30min后,后,44下下41004100rpm離心離心1010min;(5 5)棄掉上清,加入)棄掉上清,加入2ml2ml預冷的預冷的0.1mol/L0.1mol/L的的CaClCaCl,加入無菌甘油,加入無菌甘油300300l,重懸混勻重懸混勻, ,冰上放置幾分鐘;冰上放置幾分鐘;(6 6)分裝,每管)分裝,每管100l100l,液氮冷凍后,液氮冷凍后, ,保存于保存于-70-70冰箱。冰箱。 10七、挑菌、搖菌七、挑菌、搖菌 (1)離心管標號(2)每個管內吸入650l l LB+Ka 抗生素(3)用牙簽挑取單個菌(4)搖床上搖菌(時間大于8h)準備:離心管、牙簽、鑷子、LB+抗生素11
8、八、八、藍白斑篩選原理藍白斑篩選原理 藍白斑篩選-篩選重組子:根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子,如-互補、抗生素基因等。 現(xiàn)在許多載體都含有一個大腸桿菌DNA的短區(qū)段,其中有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點(MCS)。 受體菌則含編碼-半乳糖苷酶C端aa的序列。當外源基因插入時,二者溶為一體后,有-半乳糖苷酶表達,在生色底物5-溴-4-氯-3吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)培養(yǎng)基中形成藍色菌落。 而當有外源基因插入到多克隆原點,從而造成插入失活,而使lacZ基因不表達而形成白色菌斑。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。12 藍白斑篩選:(1)未轉化的菌不具有抗性,不生長;(2)轉化了空載體,即未重組質粒的菌,長成藍色菌落;(3)轉化了重組質粒的菌,即目的重組菌,長成白色菌落。13九、菌液九、菌液PCRPCR驗證驗證 加樣:
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