細胞工程第三章細胞培養(yǎng)基本方法

1、細胞工程第三章細胞培養(yǎng)基本方法一、無菌操作技術根據使用器材不同選擇正確合適的方法進行消毒和滅菌。地面：0.1%新潔爾滅或2-5%來蘇爾滅菌，紫外線照射30-50min；超凈工作臺及器具：每次實驗前95%酒精擦拭消毒，紫外線照射消毒。3.洗手和著裝：口罩、無菌服、帽子紫外線照射消毒；手部消毒。4.無菌培養(yǎng)操作：無菌操作技術要領無菌操作技術要領點燃酒精燈：加熱消毒。動作準確敏捷 ：不應太快。不用手觸及已消毒物品 操作面布局合理 操作保持一定順序 培養(yǎng)用瓶和吸管的放置 防止各種用液的交叉污染不向操作者講話或咳嗽維護各種設備，保持良好工作狀態(tài)。超凈臺內培養(yǎng)用品布局 二、培養(yǎng)細胞的觀察（一）相差顯微鏡觀

2、察（一）相差顯微鏡觀察1.原理：利用光在通過不同密度物質時的折射率和物體厚度差別，由于折射光程不同產生衍射而引起的光程變化。產生衍射而引起的光程變化。光程的變化引起相位差相位差變化來觀察物體結構。一般情況下人眼不能分辨相差，而相差顯微鏡利用光的衍射和干涉現(xiàn)象，把相差變?yōu)檎穹罴懊靼抵钕嗖钭優(yōu)檎穹罴懊靼抵?，就可以分辨出被檢物體的結構。 2.生長良好的細胞的鏡下狀態(tài)：細胞透明度大，折光性強，輪廓清。細胞透明度大，折光性強，輪廓清。 相差顯微鏡觀察時可見細胞部分細微結構。 B.若細胞生長狀態(tài)不良，可見細胞輪廓增強，細胞折光性變弱，胞質中出現(xiàn)空泡、脂滴和其他顆粒狀物質，細胞之間空隙增大，細胞形態(tài)

3、不規(guī)則，甚至失去原有細胞的特點，產生圓縮脫落，有時細胞表面及周圍出現(xiàn)絲絮狀物。發(fā)現(xiàn)這種情況應及時處理。（二）倒置顯微鏡（二）倒置顯微鏡1.光源和聚光器位于載物臺上方。2.物鏡位于載物臺下方。3.載物臺上可放置培養(yǎng)皿，便于觀察貼服于底壁上的活細胞。4.倒置顯微鏡可裝配各種輔助設備：相差長焦距聚光器、暗視野聚光器、熒光顯微鏡光源、恒溫調節(jié)器、照相機、攝影機等。5.可根據不同觀察目的選用不同的相差物鏡：正反差物鏡、PL物鏡、PLL物鏡、NH物鏡。培養(yǎng)的CHO細胞 中國倉鼠卵巢細胞中國倉鼠卵巢細胞1.用相差顯微鏡觀察細胞應注意瓶（或皿）的厚度、均勻性、清潔度、氣溫等。2.天氣較冷時，若與顯微鏡觀察處溫

4、差較大，由于溫差使培養(yǎng)瓶內壁形成霧滴而影響觀察的清晰度，此時可輕輕將瓶傾斜使瓶內培養(yǎng)液浸潤內壁培養(yǎng)液浸潤內壁，以得到好的相差像。3.若對原代細胞培養(yǎng)進行相差顯微照相，最好選擇換選擇換液液后進行。（三）相差顯微鏡觀察活細胞的注意事項細胞生長狀況有關指標的檢測方法 1. 細胞計數(shù) （四）、 培養(yǎng)細胞的觀察利用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)目，以測定細胞增殖和調整細胞濃度的方法。Cell counting using a haemocytometer 計算四角大方格計算四角大方格內的細胞數(shù)；內的細胞數(shù)；每個方格容積為每個方格容積為110-4ml細胞數(shù)/ML4大格細胞總數(shù)/410000稀釋倍數(shù)1毫

5、米計數(shù)原則：不數(shù)死計數(shù)原則：不數(shù)死細胞（染藍）、壓細胞（染藍）、壓線細胞數(shù)上不數(shù)下，線細胞數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右，一團數(shù)左不數(shù)右，一團細胞按一個計數(shù)！細胞按一個計數(shù)！ 1毫升毫升1立方厘米立方厘米 三、培養(yǎng)細胞的檢測指標 2.細胞生長曲線：觀察細胞在一代生存期內的增生過程的重要指標；培養(yǎng)時間d為橫坐標，細胞密度為縱坐標作坐標圖。條件：具備自身穩(wěn)定生長特性。 生長曲線是培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一，是測定細胞絕對生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標。 常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響！ 細胞生長曲線 3. 細胞分裂指數(shù) 細胞分裂指數(shù)是表示細胞增殖旺盛程度增殖旺盛程度的指標。它

6、以被測1000個細胞中的分裂細胞數(shù)來計算。 測定方法：用秋水仙素秋水仙素將細胞處理12小時后，按染色體制片法染色體制片法制片制片并染色，計算1000個細胞中分裂相的數(shù)目，重復4次取平均值，用百分比表示。 分裂指數(shù)=分裂細胞數(shù)/總細胞數(shù)100% 4. 細胞貼壁率 細胞貼壁率又稱細細胞接種存活率胞接種存活率。 它是細胞被制成分散的懸液后，以低密度(25個細胞/cm2)被接種到底物上，貼壁并能存活生長形成細胞小群(克隆)的細胞百分數(shù)值，用以表示細胞的生存能力和細胞群的活力。 細胞接種存活率只表示接種細胞后貼壁的細胞數(shù)，但貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆。而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的

7、細胞。 克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。 由于細胞生物學性狀不同，細胞克隆形成率差別也很大，一般初代培養(yǎng)細胞克隆形成率弱，傳代細胞系強；二倍體細胞克隆形成率弱，轉化細胞系強；正常細胞克隆形成率弱，腫瘤細胞強。5. 細胞周期 一個細胞分裂生長周期時間；與細胞群體倍增時間的區(qū)別（對數(shù)生長期內細胞數(shù)量增加一倍所用的時間）。標記有絲分裂百分率法（percentage labeledmitoses，PLM）： 對測定細胞進行脈沖標記、定時取材、利用放射自顯影技術顯示標記細胞，通過統(tǒng)計標記有絲分裂細胞百分數(shù)的辦法來測定細胞周期。放射標記物為3H或者14C標記的TdR。 G1：DNA合成

8、前期合成前期S：DNA合成期合成期G2：DNA合成后期合成后期M：有絲：有絲分裂期分裂期 6. MTT法測定細胞活力 四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍 四唑鹽比色法的原理：活細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產物甲臜（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。 二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。 MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒性試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。 活細胞率 =（細胞總數(shù)-死細胞數(shù)）/ 細胞總數(shù) x 100%三、細胞培養(yǎng)中常用的染色方法（一）活體

9、染色在體外條件下用某種染色劑對活的組織或細胞進行染色，而不影響活細胞生命活動的方法。活體染料：堿性活體染料+酸性活體染料常用堿性活體染料，使用濃度較低，0.005%、0.01%、0.1%、0.2%，采用平衡鹽溶液、PBS、生理鹽水配制。 用0.5%濃度的臺盼藍（Trypan blue）,用PBS配制，室溫保存，該染料只對死細胞死細胞著色（藍色），可測定活細胞數(shù)和計算存活百分率。 （二）染料排除檢測法熒光染料染色觀察 2.溴化乙錠（溴化乙錠（EB）和碘化丙啶（）和碘化丙啶（PI）染色）染色嵌入核酸雙鏈之間，只能標記死死細胞！ （紅色熒光）3.Acridine Orange（AO）丫啶橙直接染色觀

10、察活細胞，同時標記DNA和RNADNA：亮綠色熒光RNA：橘紅色-紅色熒光 吖啶橙(AO)能透過胞膜完整的細胞透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核嵌入細胞核DNA，使之發(fā)出明亮的綠色熒光。溴乙錠僅能透過胞膜受損的細胞胞膜受損的細胞，嵌入核DNA，發(fā)橘紅色熒光。 凋亡的細胞呈現(xiàn)為染色增強，熒光更為明亮，均勻一致的圓狀或固縮狀、團塊狀結構。非凋亡細胞核呈現(xiàn)熒光深淺不一的結構樣特征。 在熒光顯微鏡下觀察，可見四種細胞形態(tài)： 活細胞(VN)，核染色質著綠色并呈正常結構； 早期凋亡細胞(VA)，核染色質著綠色呈固縮狀或圓珠狀； 非凋亡的死亡細胞(NVN)，核染色質著橘紅色并呈正常結構； 晚期凋亡細胞(NVA)

11、，核染色質為橘紅色呈固縮狀或圓珠狀。1污染及途徑：細胞培養(yǎng)中，與培養(yǎng)無關的雜質的混入培養(yǎng)系統(tǒng)統(tǒng)稱為污染。 空氣：最主要途徑，消毒不嚴格，季節(jié)、凈化工作臺故障、濕度、溫度、周邊環(huán)境等。 器材清洗消毒不徹底 操作：基本功不扎實、不認真、不規(guī)范、交叉污染、器具消毒不嚴格等。 血清：制備水平低，支原體或病毒污染。 組織 樣本四、細胞培養(yǎng)的污染和檢測最嚴峻的挑戰(zhàn)最嚴峻的挑戰(zhàn)-污染污染(contamination) 細胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)細胞培養(yǎng)的污染問題十分重要，一旦發(fā)生污染，將導致前功盡棄。所以細胞培養(yǎng)一定生污染，將導致前功盡棄。所以細胞培養(yǎng)一定要建立要建立無菌觀念無菌觀念。遇到培養(yǎng)污染要

12、分析原因，。遇到培養(yǎng)污染要分析原因，及時處理。及時處理。 培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回，培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回，加入抗生素也基本無能為力。特別是霉菌和細加入抗生素也基本無能為力。特別是霉菌和細菌。菌。 1.細胞培養(yǎng)中常見的污染物有細菌、酵母菌、真菌、支原體和病毒等。在出現(xiàn)以下情況時培養(yǎng)的細胞可能有污染：酸堿度酸堿度發(fā)生異常的改變。b. 培養(yǎng)液出現(xiàn)混濁?；鞚帷. 光鏡觀察到菌絲和顆粒菌絲和顆粒。d. 細胞出現(xiàn)死亡或增殖緩慢死亡或增殖緩慢等 2.細菌污染：常見革蘭氏陰性菌（白色葡萄球菌） 、大腸桿菌、假單胞菌。現(xiàn)象：初期變化不明顯，后期培養(yǎng)液渾濁，鏡下可見菌體。預防：青霉素和鏈

13、霉素可預防。3.真菌污染 ：常見煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。特點：大多呈白色或淺黃色小點漂浮于培養(yǎng)液表面；鏡下呈絲狀、管狀或樹枝狀，縱橫交錯，散在細胞周邊和細胞之間?？拐婢苿┛深A防和排除真菌污染。4.支原體污染：介于細菌和病毒之間，能獨立生活的最小微生物。最常見、不易察覺；大小介于0.2-2 m，約1%可通過濾菌器 對酸耐受性差，對熱較敏感，青霉素無效 ?！罢！备杏X 。支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變支原體污染細胞后，能抑制細胞代謝和生長，改變核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改核酸合成，影響細胞的抗原性，引起細胞染色體改變，干擾變，干擾DNA的

14、復制，以及具有類病毒作用。在培的復制，以及具有類病毒作用。在培養(yǎng)細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而養(yǎng)細胞初期，由于支原體對細胞的繁殖影響較小而往往被忽略。往往被忽略。 支原體檢測方法和處理1）熒光技術檢測：支原體含有DNA，能與一種熒光染料Hoechest 33258特異性的結合，可根據細胞表面的熒光來顯示細胞是否污染有支原體。2）直接培養(yǎng)法：實驗室常用。3）放射自顯影檢測：4）DNA分子雜交及PCR法5）電鏡檢測法6）3H-胸腺嘧啶摻入法在Vero細胞核外與細胞表面會出現(xiàn)藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。 支原體污染細胞的Hoechst33258染色結果 支原體污染電鏡照片（30K） 5.病毒的污染及檢測： 借助宿主細胞進行復制裝配成新的病毒顆?；蛘系剿拗鱀NA上進行復制。1）致細胞病變效應（Cytopathic effect,CPE）或集落的檢測：采用相差顯微鏡檢測