HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質(zhì)量評價指標(biāo)

1、HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質(zhì)量評價指標(biāo)呂光華 1, 2 收稿日期 2009-08-10通信作者 * 呂光華，Tel: (028) 61800231; E-mail: ，程世瓊 3，陳金泉 2，梁士賢 2，趙中振2(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，四川 成都611137;2. 香港浸會大學(xué) 中醫(yī)藥學(xué)院，香港 九龍?zhí)? 3. 四川省食品藥品檢驗所，四川 成都610036)摘要 目的：建立HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的方法，測定不同來源的川芎樣品，以期研究其質(zhì)量評價指標(biāo)。方法：用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇0.24

2、mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）分別提取川芎樣品中的游離阿魏酸和總阿魏酸。HPLC采用Alltima C18 (4.6 mm 250 mm，5 m) 色譜柱，保護(hù)柱為C18 (4.6 mm 7.5 mm，5 m)；以乙腈和1%冰醋酸水溶液為流動相，梯度洗脫；流速為1.0 mL.min-1；柱溫為30 oC；測定波長為320 nm；進(jìn)樣量為10 L；以外標(biāo)法測定樣品中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量。結(jié)果：游離阿魏酸和總阿魏酸分別在0.01 0.20 g和0.05 0.46 g呈線性關(guān)系，回收率分別為95.7和98.5% (n = 6)。32份川芎藥材和飲片中總阿魏酸與游離阿魏酸的含量之比

3、為1.03 4.98，平均值為2.38 (n = 32); 1份川芎栽培苓子中二者之比值達(dá)19.6。15份從川芎主產(chǎn)區(qū)收集的根莖藥材中總阿魏酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.42 mg.g-1，按平均值的80%和藥材含水量10%計算，則川芎藥材中總阿魏酸的含量以干燥品計為1.25 mg.g-1。結(jié)論：本方法可測定穩(wěn)定、具有可比性的阿魏酸含量，操作簡便，適合于川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量測定。阿魏酸在川芎樣品中以游離和結(jié)合型共同存在，但以后者為主，并以總阿魏酸的量發(fā)揮藥效，故應(yīng)以總阿魏酸為川芎藥材和飲片質(zhì)量評價的指標(biāo)。 關(guān)鍵詞 川芎；游離阿魏酸；總阿魏酸；高效液相色譜法；含量測定；質(zhì)量評價川芎

4、為常用的活血化瘀藥，來源于傘形科植物川芎 (Ligusticum chuanxoing Hort.) 的干燥根莖 1?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理研究結(jié)果表明，川芎的活性成分主要包括苯酞類、酚酸類和生物堿類成分2-3。雖然對川芎中藁本內(nèi)酯 (ligustilide)、阿魏酸 (ferulic acid) 和川芎嗪 (ligustrazine) 含量測定的文獻(xiàn)報道較多 4-10, 但是在中國藥典（2005年版）中川芎仍然沒有質(zhì)量控制的指標(biāo)成分1。作者研究了大量的相關(guān)文獻(xiàn)，認(rèn)為其原因在于藁本內(nèi)酯不穩(wěn)定，對照品難以保存，純度下降；阿魏酸對照品穩(wěn)定，但報道的測定方法準(zhǔn)確性差，結(jié)果誤差大；川芎嗪被認(rèn)為是川芎藥材的特征

5、性成分，但具有升華性，供試液制備的步驟多，定量分析的結(jié)果誤差大。作者曾對當(dāng)歸中藁本內(nèi)酯和阿魏酸的測定方法進(jìn)行過深入研究11-13，認(rèn)為阿魏酸可最先作為川芎藥材和飲片質(zhì)量評價的指標(biāo)性成分。臺灣中華中藥典（2004年版）中將阿魏酸大于0.07%規(guī)定為川芎藥材的質(zhì)量控制指標(biāo) 14。為此，本研究建立了準(zhǔn)確、快速地用HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸含量的方法，并測定了33份不同來源的川芎藥材、飲片和栽培苓子樣品，分析了川芎藥材和飲片的質(zhì)量與阿魏酸含量的相關(guān)性，提出了評價川芎藥材質(zhì)量的總阿魏酸含量指標(biāo)，以期為制定川芎藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。1 儀器與材料Agilent 1100型高效液

6、相色譜儀 (美國)，配置G1322A真空在線脫氣機(jī)，G1312A四元梯度泵，G1329A自動進(jìn)樣儀，G1316A柱溫箱，G1315A二極管陣列檢測器。電子分析天平為德國Satorius (d = 0.1 mg, CP224S) 和瑞士Mettler Toledo (d = 1 g, MT5)。超聲提取器為Branson 5510E-MTH型（美國）。阿魏酸對照品購于中國藥品生物制品檢定所（北京），其純度用HPLC色譜峰的面積歸一化法計算大于98.0%。甲醇（分析純）和乙腈（色譜純）為Lab-scan (泰國)，分析純的甲酸、冰醋酸和碳酸氫鈉為Uni-chem (波蘭); 純凈水由Millipo

7、re凈水器 (美國)產(chǎn)生。33份川芎樣品從川芎的道地產(chǎn)區(qū)四川省都江堰市、彭州、崇州和非地道產(chǎn)區(qū)以及香港不同公司收集 (表1)，由香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院趙中振教授和呂光華博士鑒定。2 方法2.1 色譜條件 Alltima C18 色譜柱(4.6 mm 250 mm, 5 m)；C18保護(hù)柱(4.6 mm 7.5 mm，5 m)；流動相由乙腈和1%冰醋酸水溶液組成，梯度洗脫，0 18 min乙腈19%，18 60 min乙腈19% 100%；流速1.0 mL.min-1；柱溫為30 oC；測定波長為320 nm，HPLC-DAD在線收集紫外光譜的范圍為200 400 nm；進(jìn)樣量為10 L。在該色

8、譜條件下，阿魏酸峰達(dá)到基線分離。對照品和川芎供試液的色譜圖見圖1。(A)(B)圖1 對照品及樣品HPLC圖 A. 對照品; B. 供試品; a. 游離阿魏酸的測定; b. 總阿魏酸的測定；1. 阿魏酸; 2. 阿魏酸松柏酯2.2 對照品溶液制備及線性范圍考察2.2.1 制備測定游離阿魏酸的對照品溶液 精密稱取2.5 mg阿魏酸對照品，置25 mL棕色量瓶中，加甲醇-甲酸（95 : 5）稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為100 mg.L-1 的對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液100, 300, 500, 700, 900 mL, 1.2, 1.5, 2.0 mL于10 mL量瓶中，加甲醇-甲酸(

9、95 : 5)稀釋至刻度，搖勻。2.2.2 制備測定總阿魏酸的對照品溶液 精密稱取5.0 mg阿魏酸對照品，置10 mL棕色量瓶中，加甲醇0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為 500 mg.L-1 的對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液100, 200, 300, 500, 700, 900 mL于10 mL量瓶中，加甲醇0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）稀釋至刻度，搖勻。2.2.3 線性范圍考察 依選定的色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積 (mAU.s)與對照品進(jìn)樣量(mg)進(jìn)行線性回歸，得測定游離阿魏酸和總阿魏酸的回歸方程分別為Y

10、 = 5 542.2X 1.829 (r = 0.999 8，n = 8) 和Y = 5 588.7X - 9.999 (r = 0.999 6，n = 6)。結(jié)果表明，用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）分別配制的阿魏酸溶液，進(jìn)樣量在0.01 0.20 g和0.05 0.46 g范圍內(nèi)分別與其峰面積呈良好的線性關(guān)系。本研究中將測定游離阿魏酸和總阿魏酸的對照品溶液分別制備的目的是與供試液相對應(yīng)，盡量減小分析誤差。用這兩種溶劑制備的對照品溶液，阿魏酸的保留時間一致，紫外光譜相同；將二者的進(jìn)樣量(mg)與峰面積(mAU.s)合并在一起計算，回歸方

11、程為Y = 5 582.8X - 6.526 (r = 0.999 7，n = 14)，線性仍然良好。2.3 供試液的制備 取樣品粉末（20目） 0.5 g, 精密稱定，置60 mL具密封蓋的棕色瓶中，精密加入甲醇-甲酸（95 : 5）25 mL, 密閉，稱定重量；超聲提取90 min后取出, 稱重，補足失重；搖勻，靜置；取上清液經(jīng)0.20 m微孔濾膜過濾，即得游離阿魏酸的供試液。重復(fù)1次，制備1份平行供試液。以甲醇 0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）為溶劑， 同法制得總阿魏酸的供試液。2.4 精密度試驗 以對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣和樣品粉末重復(fù)測定的結(jié)果分別評價儀器的重復(fù)性和分

12、析方法的重復(fù)性。取用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）配制的對照品溶液各1份，依選定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，其RSD分別為1.20%和1.12% (n = 6)。取1藥材粉末，分別用上述兩種溶劑制備6份供試液，測定游離阿魏酸和總阿魏酸的含量，其RSD分別為1.67%和0.85% (n = 6)。2.5 回收率試驗 取已知阿魏酸含量的川芎藥材粉末約0.25 g，各6份，精密稱定。分別精密加入游離阿魏酸量(0.2mg)和總阿魏酸量(0.85mg)的對照品溶液,甲醇-甲酸（95 : 5）或甲醇0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95

13、 : 5）溶液。按照供試液制備方法制成供試液，測定游離阿魏酸和總阿魏酸的含量。其平均回收率分別為95.7 3.85% ( RSD, n = 6)和98.5 1.64% (n = 6)。2.6 樣品測定 每份樣品粉末稱取2份，按照供試液的制備方法制成供試液，各進(jìn)樣測定2次。根據(jù)回歸方程計算樣品中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量。33份川芎樣品中游離阿魏酸和總阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其比值見表1。表1 不同來源的川芎樣品中游離阿魏酸和總阿魏酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù) mg.g-1No.樣品類型來 源游離阿魏酸1)總阿魏酸 1)總阿魏酸/游離阿魏酸1根莖四川都江堰0.409 1.543.762根莖四川都江堰0.472 1.5

14、13.203根莖四川都江堰0.351 1.584.504根莖四川都江堰0.379 1.704.495根莖四川都江堰0.679 1.241.826根莖四川彭州0.565 1.091.937根莖四川彭州0.410 1.794.388根莖四川彭州0.505 0.8981.789根莖四川彭州0.769 1.351.7610根莖四川彭州0.591 1.622.7311根莖四川彭州0.462 1.423.0712根莖四川崇州0.569 1.272.2313根莖四川崇州0.301 1.504.98 14根莖四川什邡0.522 1.132.17 15根莖四川蒼溪0.491 1.623.31 16根莖云南0.5

15、31 1.452.73 17根莖陜西南鄭0.394 0.5191.32 18根莖香港公司10.516 0.8141.58 19根莖香港公司20.442 0.6161.39 20根莖香港公司30.548 0.6581.20 21根莖香港公司40.267 0.2981.12 21小塊(約1cm)四川都江堰0.289 0.3851.33 23小塊(約1cm)四川汶縣0.430 0.7451.73 24小塊(約1cm)云南0.905 1.121.23 25小塊(約1cm)云南0.912 1.201.31 26小塊(約1cm)陜西0.542 0.8011.48 27小塊(約1cm)福建0.742 1.1

16、11.49 28飲片四川都江堰0.338 1.343.96 29飲片四川彭州0.499 1.002.01 30飲片四川彭州0.258 1.094.21 31飲片香港公司50.219 0.2251.03 32飲片香港公司60.333 0.3521.06 33栽培用苓子四川茂縣0.102 2.0019.6注: 1) 此數(shù)值 (, n = 2) 為測定計算值，未以干燥品計。3 討論3.1 測定川芎藥材和飲片中阿魏酸含量的方法由于阿魏酸與阿酸酸松柏酯(coniferyl ferulate，CF)共同存在于植物組織中，CF很容易水解成阿魏酸，其水解程度不同而影響供試液中阿魏酸的量15-16。因此，只有阻

17、止CF水解而測定供試液中的游離阿魏酸，或者促進(jìn)CF完全水解而測定供試液中總阿魏酸的含量才能得到具有可比性的阿魏酸值。作者曾研究過不同溶劑（甲醇、甲醇-甲酸、甲醇-鹽酸、甲醇-水、水、甲醇-碳酸氫鈉水溶液、甲醇-氨水，乙腈）和不同提取方法（超聲波常溫下提取、超聲波50 oC恒溫提取、回流提取）對當(dāng)歸藥材中阿魏酸含量的影響及其穩(wěn)定性，用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇-0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）為溶劑超聲波提取，可分別提取藥材中的游離阿魏酸和總阿魏酸，且結(jié)果穩(wěn)定，具有可比性12-13。川芎與當(dāng)歸親緣關(guān)系相近，化學(xué)成分相近。研究結(jié)果表明，這兩種溶劑也適合于提取川芎藥材和飲

18、片中的游離阿魏酸和總阿魏酸。因本研究中未獲得CF對照品，CF的色譜峰根據(jù)在線HPLC-UV和MS數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值比較而鑒定15-16。在200 400 nm的紫外光譜中，其吸收峰位于270 nm，299 nm (肩峰) 和318 nm (最大峰)。在APCI-MS負(fù)離子譜中可見其負(fù)分子離子峰355 m/z M-H- 和阿魏酸部分的負(fù)離子碎片峰193 m/z；在APCI-MS正離子譜中可見松柏醇(coniferyl alcohol) 部分的正離子碎片峰163 m/z。用甲醇-甲酸（95 : 5）和甲醇-0.24 mol.L-1碳酸氫鈉水溶液（95 : 5）制備的阿魏酸對照品溶液和川芎樣品經(jīng)超聲提取制

19、成的供試液在常溫、常壓下保存5 d，其間測定10次，阿魏酸的峰面積變化值小于2%，HPLC圖無變化，說明阿魏酸在5 d內(nèi)穩(wěn)定。超聲提取時間比較了45，60，75，90，105和120 min游離阿魏酸和總阿魏酸含量。結(jié)果表明，提取75 min以后的含量不再增加?？紤]川芎樣品之間的差異，選擇提取時間為90 min。阿魏酸和CF的最大紫外吸收波長分別位于322 和318 nm，選擇320 nm為檢測波長以便在同一張HPLC圖中同時觀察阿魏酸和CF峰。此外，本方法中流動相采用梯度洗脫，以便在測定總阿魏酸的含量時，監(jiān)測CF是否水解完全。3.2 川芎樣品中游離阿魏酸和總阿魏酸的比較從表1中看出，總阿魏酸

20、的量大于游離阿魏酸的量。32份川芎藥材和飲片中總阿魏酸與游離阿魏酸之比值為1.03 4.98，其均值為2.38 (n = 32)，而川芎的栽培苓子中二者之比值達(dá)19.6，說明阿魏酸在植物組織中以結(jié)合型存在為主?？傮w趨勢是總阿魏酸含量越高，與游離阿魏酸之比值越大。由于中藥飲片常用水煎煮，CF在水溶液中加熱條件下全部水解成阿魏酸，以總阿魏酸的量發(fā)揮藥效12-13。因此，川芎藥材和飲片應(yīng)以總阿魏酸為質(zhì)量評價的指標(biāo)。3.3 川芎藥材中總阿魏酸含量的指標(biāo)川芎是四川省的道地藥材，主產(chǎn)于四川省都江堰市、彭州、崇州等地。從四川收集的15份根莖藥材（表1，No. 1 15）中，總阿魏酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.42

21、mg.g-1 (n = 15)。按平均值的80%和藥材含水量10%計算，則總阿魏酸的含量以干燥品計為1.25 mg.g-1。由于從其他產(chǎn)區(qū)收集到的川芎樣品數(shù)量少，代表性不強(qiáng)，以及受貯藏時間和加工方式的影響，不能歸納出總阿魏酸的含量與川芎藥材產(chǎn)地之間的相關(guān)性。但是，研究過程中發(fā)現(xiàn)，按川芎性狀鑒別質(zhì)量好的藥材，其總阿魏酸的含量高；含水量高，貯藏過程中變質(zhì)、變味的藥材，總阿魏酸的含量較低；貯藏時間長，總阿魏酸的含量降低；根莖藥材加工后，總阿魏酸的含量也降低（表1，No. 21 32）。從香港6家公司收集的川芎藥材和飲片中總阿魏酸的含量相對較低（表1，No. 18 21，31 32），可能與貯藏、加工

22、方式不同有關(guān)。致謝 四川大學(xué)華西藥學(xué)院張浩教授，唐心曜教授和香港浸會大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院易濤博士提供部分實驗樣品。參考文獻(xiàn)1 中國藥典. 一部 M. 2005: 28.2 肖培根. 新編中藥志. 第1卷 M. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2002: 121.3 國家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會. 中華本草. 第5卷 M. 上海: 上?？茖W(xué)技術(shù)出版社, 1999: 976, 893.4 林燕芝, 唐星, 畢開順. RP-HPLC測定川芎揮發(fā)油中藁本內(nèi)酯的含量J. 中國中藥雜志, 2004, 29(2): 154.5 汪程遠(yuǎn), 張浩, 錢忠明. HPLC測定不同川芎藥材中藁本內(nèi)酯J. 中草藥, 2006,

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28、nation of free ferulic acid and total ferulic acid in Chinese Chuanxiong by high-performance liquid chromatography for quality assessmentLU Guang-hua 1, 2, CHENG Shi-qiong 3, CHAN Kelvin 2, LEUNG Kelvin S.Y. 2, ZHAO Zhongzhen 2 (1. Key Laboratory of Ministry of Education in China on the Standardizat

29、ion of Chinese Materia Medica, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China;2. School of Chinese Medicine, Hong Kong Baptist University, Kowloon Tong, Hong Kong;3. Sichuan Provincial Institute for Food and Drug Control, Chengdu 610036, China)Abstract

30、Ferulic acid (FA) is one the main bioactive compounds in Chinese Chuanxiong (CX, Szechwan Lovage Rhizome), the dried rhizome of Ligusticum chuanxiong Hort., but its amount in this herb is not known. An accurate and rapid high-performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed to investigate on the available amount of FA i.e. free FA and total FA. Herbal samples were extracted in methanol-formic acid (95:5) and methanol-0.24 mol.L-1 sodium hydrogen carbonate in water (95:5), respectively and then quantitatively analyzed by HPLC method. Altogether 33