CFX_熒光定量PCR儀操作指引Bio-rad

1、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCRZ操作流程及注意事項(xiàng)開始運(yùn)行儀器打開電腦打開定量PCR儀底座開關(guān)啟動CFXManager軟件放置樣品將PCR應(yīng)體系加入到0.2ml低緣八聯(lián)管，蓋上管蓋；或加入低緣96孔板，用光學(xué)級封膜封好。注意，必須帶一次性塑料手套，不要讓手指接觸到反應(yīng)管表面。將反應(yīng)管按順序放入儀器的加熱孔中。設(shè)置程序，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)定量PCR軟件操作基本步驟為：a.設(shè)置熱循環(huán)程序文件(ProtocolTab)b.設(shè)置反應(yīng)板文件(PlateTab)。C.點(diǎn)擊“StartRun”鍵，運(yùn)行程序熱循環(huán)程序文件(ProtocolTab)設(shè)置指南：點(diǎn)擊Edit(編輯)或CreateNew(創(chuàng)建新程序)。反應(yīng)板設(shè)置

2、文件(PlateTab)設(shè)置指南：選擇本次實(shí)驗(yàn)所要使用的熒光染料種類；單擊樣品類型；如要某些反應(yīng)孔第一熒光染料對應(yīng)的樣品類型為標(biāo)準(zhǔn)品(Standard)，點(diǎn)擊"DilutionSeries"鍵可設(shè)置其標(biāo)準(zhǔn)品濃度及稀釋倍數(shù)。點(diǎn)擊"StartRun"鍵。單擊openlid(打開熱蓋)或Closelid(關(guān)閉熱蓋)放置樣品；單擊StartRun,保存文件，開始運(yùn)行程序。結(jié)果分析PC皈應(yīng)結(jié)束后，軟件會自動計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線和Ct值等。如需進(jìn)行表達(dá)量分析、等位基因分析等，在軟件窗口選擇相應(yīng)分析功能。點(diǎn)擊右上方的“Report”鍵，還可輸出結(jié)果報(bào)告單關(guān)閉運(yùn)行儀器實(shí)驗(yàn)結(jié)束后

3、取出反應(yīng)管，順序關(guān)閉CFXManager軟件、定量PC敬電源，關(guān)閉電腦。注意！CFX儀器上蓋部分為全自動控制，在通電狀態(tài)，嚴(yán)禁任何人為干涉上蓋開啟或關(guān)閉的行為，此類行為會導(dǎo)致上蓋故障，危及儀器使用。CFXManager軟件操作快速指南實(shí)驗(yàn)操作程序設(shè)置圖1顯示實(shí)驗(yàn)設(shè)置窗口中一個(gè)預(yù)覽的程序。點(diǎn)擊CreateNew,打開程序編輯器創(chuàng)建一個(gè)新的程序。點(diǎn)擊SelectExisting,通過瀏覽器加載一個(gè)程序或?qū)ζ溥M(jìn)行編輯。使用ExpressLoad下拉菜單直接加載一個(gè)程序或?qū)ζ溥M(jìn)行編輯。點(diǎn)擊EditSelected,打開程序編輯器編輯所選程序的各個(gè)步驟。點(diǎn)擊StartRun開始運(yùn)行當(dāng)前加載的程序。程序編

4、輯器程序編輯器可用來創(chuàng)建一個(gè)新程序或編輯一個(gè)已存在的程序，圖21 .在圖形或文本模式下選擇任何需要編輯的一步（該步驟會用藍(lán)色高亮顯示），點(diǎn)擊溫度或保持時(shí)間進(jìn)行直接編輯。2 .點(diǎn)擊InsertStep在程序中增加一個(gè)溫度步驟。點(diǎn)擊DeleteStep在程序中刪除選中的步驟。3 .點(diǎn)擊AddPlateReadtoStep,在程序中指定獲取熒光數(shù)據(jù)的時(shí)間。如果當(dāng)前的高亮顯示步驟已經(jīng)進(jìn)行了讀板設(shè)置，則這一選項(xiàng)變?yōu)镽emovePlateRead。如果在這一步不想獲取數(shù)據(jù)，則點(diǎn)擊RemovePlateRead。4 .點(diǎn)擊GOTO步驟的重復(fù)次數(shù)，改變程序中的循環(huán)次數(shù)，圖2第4步。點(diǎn)擊GOTO驟數(shù)可改變GOT

5、O循環(huán)中所包含的步驟。增加一個(gè)梯度步驟：1 .在程序編輯控制窗口中，點(diǎn)擊InsertGradient，圖2。2 .對梯度中最低和最高溫度值進(jìn)行編輯，在圖形模式，文本模式下或出現(xiàn)在文本模式右側(cè)的梯度范圍計(jì)算器中直接點(diǎn)擊數(shù)值進(jìn)行編輯，圖3。3 .在梯度范圍計(jì)算器中，對任何一行都可以賦予一個(gè)指定的溫度。每行的溫度都會調(diào)整為合適的溫度來滿足指定的溫度范圍。增加熔解曲線：1 .在程序編輯控制窗口中，點(diǎn)擊InsertMeltCurve，圖2。2 .在圖形或文本顯示模式下，點(diǎn)擊溫度值來編輯融解曲線范圍的最低和最高溫度，圖4第5步1950CfattIO3C加胤也fof005+FlweRe«JENO3

6、 .點(diǎn)擊增量值來編輯數(shù)據(jù)獲取的溫度區(qū)間4 .點(diǎn)擊保持時(shí)間編輯每一個(gè)增量溫度的保持時(shí)間選中的孔是藍(lán)色的，未選中的孔是亮灰色的。若把光標(biāo)置于熒光信號曲線上，孔選擇器中的孔上，數(shù)據(jù)電CFXManager軟件數(shù)據(jù)分析快速指南定量分析數(shù)據(jù)瀏覽子表格的孔上，或者標(biāo)準(zhǔn)曲線上均可以顯示出相應(yīng)的信息擴(kuò)增圖表可以顯示實(shí)驗(yàn)中每個(gè)循環(huán)每個(gè)孔收集的相對熒光信號曲線。點(diǎn)擊位于擴(kuò)增圖表下方的熒光檢查窗，選擇需要顯示的熒光數(shù)據(jù)，圖1。在孔選擇器中點(diǎn)擊孔，行或列來顯示所選孔的熒光數(shù)據(jù)，圖1數(shù)據(jù)分析選項(xiàng)CFXManager軟件可以自動的扣除從各個(gè)孔所得數(shù)據(jù)的基線。從菜單欄中選擇Settings,選擇BaselineThresho

7、ld可以改變基線范圍。軟件會自動計(jì)算基線的位置?？梢渣c(diǎn)擊并拖動閥值線來手動定位。點(diǎn)擊工具欄中View/EditPlate按鈕來編輯孔的內(nèi)容，可以臨時(shí)創(chuàng)建新的分群，從分析中增加或刪掉一些孔。-圖表選項(xiàng)可用鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來復(fù)制或保存圖像，或選擇ChartOptions來改變軸范圍或刪除柵格，圖2。點(diǎn)擊工具欄中TraceStyles按鈕，或鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊任何圖表來設(shè)定制定孔的熒光信號曲線顏色。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任何圖表，向下和拖動光標(biāo)可以放大圖表?？椎姆秩簲?shù)據(jù)瀏覽使用工具欄中SelectWellGroup下拉菜單來瀏覽指定孔的分群數(shù)據(jù)，圖3。軟件可以針對每個(gè)分群作為獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)來處理，每一個(gè)分群可針對自

8、己的設(shè)置進(jìn)行分析，如進(jìn)行自身標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析。AlWeis4.定量數(shù)據(jù)分析顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口中QuantitationData,瀏覽數(shù)據(jù)計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，包括每個(gè)孔的閥值（CT）和平均值以及復(fù)制的標(biāo)準(zhǔn)偏差，圖4。點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題進(jìn)行基于列的行分類。鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子表格并選擇Sort可進(jìn)行基于多個(gè)列的行分類。鼠標(biāo)左鍵點(diǎn)擊任一列的標(biāo)題并向左或向右拖動可以重新排列電子表格中列的順序。鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊電子表格，選擇數(shù)據(jù)輸出格式如text,XM或Excel輸出數(shù)據(jù)，圖4。從QuantitationData下拉菜單中選擇Plate,在反應(yīng)板柵格模式下顯示所選熒光的孔數(shù)據(jù)。創(chuàng)建報(bào)告顯示選項(xiàng)點(diǎn)擊數(shù)據(jù)分析窗口工具欄中

9、Report按鈕，圖1,打開Report窗口，圖5。點(diǎn)擊報(bào)告選項(xiàng)列表中的檢查窗，使制定信息包含在報(bào)告中，這些信息在預(yù)覽部分中會有所顯示，圖5。點(diǎn)擊工具欄中File并選擇Save,以PDF格式保存報(bào)告,或選擇Print打印報(bào)告。也可以保存報(bào)告為其它的文件格式。nsCFXManager軟件基因表達(dá)分析快速指南通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)馁|(zhì)量控制，您可以使用GeneExpressionModuleofCFXManager軟件來評估樣品之間靶標(biāo)濃度的相對差異。這種應(yīng)用最常用的使用是評估cDNA樣品中靶標(biāo)的濃度來推斷其mRNA水平。通常，一個(gè)或多個(gè)參照基因的含量被用來衡量目標(biāo)基因的水平。參照基因用來校正上樣的差異或各樣品

10、取樣的差異。通過生物學(xué)條件的研究，參照基因的表達(dá)水平通常不發(fā)生變化。基因表達(dá)分析設(shè)置圖1顯示各樣品孔含單一的熒光，四個(gè)復(fù)制類群，包含兩個(gè)不同靶標(biāo)名稱和兩個(gè)不同的樣品名稱。指定參照基因圖11 .點(diǎn)擊反應(yīng)板編輯器中ExperimentSettings或GeneExpressionModule,打開實(shí)驗(yàn)設(shè)置窗口,EpartwM2 .選擇Targets。3 .點(diǎn)擊合適的檢查窗選擇將被使用為參照基因的靶標(biāo)。4 .點(diǎn)擊ShowAnalysisSettings檢查窗，為靶標(biāo)設(shè)置反應(yīng)擴(kuò)增效率。5 .AutoEfficiency檢查窗被默認(rèn)設(shè)定。如果實(shí)驗(yàn)中運(yùn)行一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算得到的擴(kuò)增效率將在計(jì)算

11、中被使用?；蛘邔线m的靶標(biāo)輸入指定反應(yīng)擴(kuò)增效率值，則計(jì)算中將使用這一擴(kuò)增效率值。指定對照樣本1 .在ExperimentSettings窗口，選擇Samples標(biāo)簽2 .點(diǎn)擊合適的檢查窗，選擇在計(jì)算中將被作為對照的樣本，圖3。對每個(gè)基因來說，對照樣本的值被指定為1,同時(shí)所有其他樣本相對于對照樣本的值會被顯示出來基因表達(dá)分析選擇分析模式4:1.從Mode下拉菜單中選擇分析模式，圖a.NormalizedExpressionAAC(t)-靶標(biāo)基因的相對量可通過樣本的參照基因來進(jìn)行相對量的衡量。b.相對量/C(t)-靶標(biāo)基因的相對量不能被衡量；結(jié)果顯示的是實(shí)驗(yàn)中靶標(biāo)基因相對于其他樣品的基因濃度。圖形選項(xiàng)1 GraphData下拉菜單中選擇對照相關(guān)或零相關(guān)的圖形數(shù)據(jù)。在表中，GraphData選項(xiàng)默認(rèn)是對照相關(guān)。2 X軸下拉菜單中選擇X軸以Sample顯示或Target顯示。3 丫軸下拉菜單中選擇Linear,Log2或LoglO作為丫軸刻度。4 ScalingOption下拉菜單中選擇Highest,Lowest或Unscaled。5 ErrorType下拉菜單中選擇StandardErroroftheMean或StandardDeviation。6鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)擊圖形菜單選擇Sort選項(xiàng)來指定X軸的顯示順序。7鼠標(biāo)右鍵