淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用

1、淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用               作者：熊平源 郭凱文 唐朝輝 白惠卿【關鍵詞】  淫羊藿；,T淋巴細胞；,IL摘  要：  目的：探討淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。方法：采用 3HTdR標記法，測定淫羊藿對NK細胞毒活性的影響及淫羊藿對ConA誘導小鼠T淋巴細胞的轉化活性影響；通過ELISA法測定淫羊藿對小鼠脾細胞產(chǎn)生IL2的影響；利用流式細胞術，檢測淫羊藿對T淋巴細胞CD3、CD4、CD8、CD

2、4 / CD8陽性細胞百分率的影響。結果：中、高劑量組均能增強NK細胞的細胞毒活性(P0.01）；中、高劑量組均能增強ConA誘導小鼠T淋巴細胞的轉化活性(P0.01）；各劑量組均能增強脾細胞IL2的產(chǎn)生（P0.01）；各劑量組CD8陽性細胞百分率明顯降低， CD4 / CD8陽性細胞百分率顯著提高(P0.01）。結論: 淫羊藿對小鼠免疫功能有明顯的調(diào)節(jié)作用。關鍵詞：  淫羊藿；  T淋巴細胞；  IL2；  NK細胞  淫羊藿（Epimedium Kereanum Nakai）具有補腎陽、強筋骨、祛風濕的功效。淫羊藿藥用歷史悠久 ,來源于小檗

3、科淫羊藿屬的多種植物。李時珍在本草綱目中稱其有“益精氣、堅筋骨、補腰膝、強心力”之功效?，F(xiàn)代藥理實驗研究表明 ,淫羊藿能增加心腦血管血流量 ,促進造血功能、免疫功能及骨代謝 ,具有抗衰老、抗腫瘤等功效。本研究通過小鼠NK細胞活性測定試驗、淋巴細胞轉化試驗、IL2活性測定試驗、流式細胞術測定試驗等以進一步了解淫羊藿對小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用。1  材料Ba1b/c品系小鼠，體重1822g，雌雄各半，由北京大學醫(yī)學實驗動物中心提供。淫羊藿由中藥店購置。ConA為Sigma公司產(chǎn)品，3HTdR由中國科學院原子能研究院同位素研究所提供，小鼠IL2 ELISA試劑盒為晶美生物工程有限公司產(chǎn)品。N

4、K敏感細胞株Yac1細胞由北京大學醫(yī)學部免疫學系提供。流式細胞儀：FACS Can 型，是美國BactonDickson 公司產(chǎn)品。2  方法與結果  100%藥液的制備：取干燥生藥20g，加水100200ml，置冰箱中24h，然后將水浸生藥武火煮沸，并以文火煎煮，維持30min，用紗布粗濾，留濾液，再將殘渣用水100200ml煎煮30min，再濾除殘渣。兩次濾液合并，濃縮至20ml，即每ml含藥量1g，調(diào)pH至7.4，再以1500rpm離心15min，取上清液備用1。小鼠隨機分成5組，每組10只。正常對照組：每只每日用0.25ml生理鹽水連續(xù)灌胃10d;造模對照組：給予

5、60CO照射造模，一次性 60CO 射線400 rad全身照射，劑量率213.93倫/min，時間103 s1;藥物實驗組：同等條件下一次性 60CO 射線照射后藥物I組給予淫羊藿1g /（kg.d）體重，連續(xù)灌胃10d;藥物II組給予淫羊藿10g /（kg.d）體重，連續(xù)灌胃10d;藥物III組給予淫羊藿50g /（kg.d）體重，連續(xù)灌胃10d2。21  NK細胞活性測定試驗取Yac1細胞和效應細胞懸液各50l（效靶比為100:1），加入96孔培養(yǎng)板中，再加入0.1ml培養(yǎng)液,同時設效應細胞和靶細胞對照,置375%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h。滲入0.5Ci/20mld的3HTdR，培

6、養(yǎng)6h后收獲。用多頭細胞收集器將細胞收集于纖維素濾膜上，用蒸餾水反復沖洗，再滴加50.0g/L三氯醋酸2ml，使樣品固定，無水乙醇2ml流洗脫色后，置于80烘箱內(nèi)干燥30min。將烘干的濾膜放入盛有5ml閃爍液的測量杯中，置于液體閃爍儀中測Cpm值。每份樣品設三個復孔2,4,6。結果見表1。表1  淫羊藿對NK細胞活性的影響（略）表1結果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的效應細胞與靶細胞共同培養(yǎng)6h后，藥物組和藥物組與造模對照組比較，NK細胞的細胞毒活性均明顯增強（P0.01）。22  淋巴細胞轉化試驗 將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾、剪碎、研磨、過濾，用含10%小牛血清的IMDM培

7、養(yǎng)液制備脾細胞懸液，使細胞濃度為1×106個/ml。取100l于96孔培養(yǎng)板中，加入10.0g/mlConA，每孔終體積為200l。37培養(yǎng)48h后加入 3HTdR 2lCi/孔，繼續(xù)培養(yǎng)12h后收獲。用多頭細胞收集器收集細胞于纖維素濾膜上，用蒸餾水反復沖洗后，再滴加50.0g/L三氯醋酸2ml，使樣品固定，無水乙醇2ml流洗脫色后，置于80烘箱內(nèi)干燥30min。將烘干的濾膜放入盛有5ml閃爍液的測量杯中，置于液體閃爍儀中測Cpm值。每份樣品設三個復孔3,6。結果見表2。表2結果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的小鼠淋巴細胞與ConA共同培養(yǎng)48h后，與造模對照組比較，藥物組和藥物組均能明

8、顯增強ConA誘導淋巴細胞的轉化活性（P0.01）。百事通 23  IL2活性測定試驗  取1×106個/ml濃度的小鼠脾細胞懸液100l于96孔培養(yǎng)板中，加入10.0g/ml ConA，每孔終體積為200l。取上清凍存于-20。參照小鼠IL2 ELISA試劑盒，測定OD450值2,5。結果見表3。表2  淫羊藿對淋巴細胞轉化活性的影響略表3結果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的小鼠淋巴細胞在ConA刺激下產(chǎn)生IL2的能力，與造模對照組比較，藥物I組、藥物組和藥物組均能明顯增強ConA誘導淋巴細胞產(chǎn)生IL2的能力（P0.01）。24  流式細胞術測定

9、試驗 取1×107個/ml濃度的小鼠脾細胞懸液100l于小離心管中，分別加入FTTC標記的CD3，PE標記的CD4 、CD8抗體10l，振蕩混勻，室溫下避光放置30min，用PBS洗滌2次，再加500l PBS混勻，10min后用流式細胞儀檢測CD3 、CD4 、CD8 、CD4 /CD8的陽性表達率5。結果見表4。表4  淫羊藿對T淋巴細胞亞群的影響略    表4結果顯示，不同濃度淫羊藿處理后，能促進 60CO 射線照射小鼠CD4/CD8 T淋巴細胞的恢復，增加CD4/CD8 T淋巴細胞比值。藥物處理各組與造模對照組比較，P0.01。3

10、60; 討論NK細胞屬于非特異性免疫細胞，它們無需抗原預先致敏，就可直接殺傷某些腫瘤細胞和病毒感染靶細胞，在機體抗腫瘤和早期抗病毒和胞內(nèi)寄生菌感染的免疫過程中起重要作用。在腫瘤或病毒特異性IgG抗體存在條件下，NK細胞還可通過表面IgGFCR介導，識別殺傷與IgG抗體特異性結合的腫瘤細胞或病毒感染的靶細胞。此外，NK細胞活化后，還可通過分泌IFN、IL2和TNF等細胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。因此，NK細胞具有抗腫瘤、抗感染、免疫調(diào)節(jié)等功能。表1結果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的效應細胞與靶細胞共同培養(yǎng)6h后，藥物組和藥物組與造模對照組比較，NK細胞的細胞毒活性均明顯增強。T淋巴細胞表面表達有多種能

11、結合絲裂原的膜分子，其結合絲裂原的特異性由糖基特點決定。與相應絲裂原結合后，可直接誘導靜息T淋巴細胞活化、增殖和分化。表2結果顯示，不同濃度淫羊藿處理后的小鼠淋巴細胞與ConA共同培養(yǎng)48h后，與造模對照組比較，藥物組和藥物組均能明顯增強ConA誘導淋巴細胞的轉化活性。IL2主要由活化的T淋巴細胞產(chǎn)生，可作用于多種免疫效應細胞，包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞等，并能誘導產(chǎn)生新型的殺傷細胞，如淋巴因子激活的殺傷細胞（LAK）?，F(xiàn)已證明，T淋巴細胞、B淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞表面均表達IL2R，IL2可與其表面的IL2R結合而對這些細胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。表3結果顯示，不同濃度淫

12、羊藿處理后的小鼠淋巴細胞在ConA刺激下產(chǎn)生IL2的能力，與造模對照組比較，藥物I組、藥物組和藥物組均能明顯增強ConA誘導淋巴細胞的轉化活性。特異性細胞免疫的效應細胞主要是Th1型的CD+4細胞和CD+8CTL細胞。前者經(jīng)活化M而誘生炎癥性遲發(fā)型超敏反應，在宿主抗胞內(nèi)病原感染中起重要作用；后者通過分泌細胞毒素及誘導細胞凋亡以帶病原的靶細胞。表4結果顯示，不同濃度淫羊藿處理后，能促進 60CO 射線照射小鼠CD4/CD8 T淋巴細胞的恢復，增加CD4/CD8 T淋巴細胞比值，藥物處理各組與造模對照組比較。本研究結果從通過檢測小鼠NK細胞殺傷活性、淋巴細胞轉化活性及IL2分泌活性和CD4/CD8

13、 T淋巴細胞比值等證明了淫羊藿對小鼠免疫功能有增強作用和對免疫應答的調(diào)節(jié)作用，對開發(fā)利用淫羊藿這一天然藥物具有實際意義。參  考  文  獻1  陳國聯(lián)，任茜，李強，等.16種藥用忍冬的抗菌作用實驗研究. 武漢冶醫(yī)學報,1991,27（1）：14.2  熊平源，郭明雄，張文仁，等. 三普蟲草精對小鼠免疫功能影響的實驗研究. 武漢冶金科技大學學報,1999,22（1）：9295.3  劉小雨，沈自尹，王奇,等. EF對老齡大鼠Th1、Th2、Th3細胞的調(diào)節(jié)作用. 中國免疫學雜志,2005,21（11）：842845.4  Kumagai K，Itoh K，Suzuki R， et al.Studies of murine large granular lymphocytes 1,identificati