實(shí)驗(yàn)非變性PAGE膠電泳(活性電泳)

1、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、了解非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理和優(yōu)勢；2、掌握如何活性電泳和染色的步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 (Native-PAGE)或稱為活性電泳是在不加入SDS和疏基乙醇等變性劑的條件下，對(duì)保持活性的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，常用于酶的鑒定、同工酶分析和提純。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據(jù)其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質(zhì)和酶等生 物大分子的生物活性，對(duì)于生物大分子的鑒定有重要意義，

2、其方法是在凝膠上進(jìn)行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色， 對(duì)某個(gè)特定的生物大分子進(jìn)行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。非變性聚丙烯酰胺凝膠和變性 SDS-PAGE電泳在操作上基本上是相同的，只是非 變性聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳緩沖液中不能含有變性劑如SDS等。一般蛋白進(jìn)行非變性凝膠電泳要先分清是堿性還是酸性蛋白。分離堿性蛋白時(shí)候，要利用低pH凝膠系統(tǒng)，分離酸性蛋白時(shí)候，要利用高pH凝膠系統(tǒng)。酸性蛋白通常在非變性凝膠電泳中采用的pH是8.8的緩沖系統(tǒng)，蛋白會(huì)帶負(fù)電荷，蛋白會(huì)向陽極移動(dòng)；而堿性蛋白通 常電泳是在微酸性環(huán)境下進(jìn)行，蛋白帶

3、正電荷，這時(shí)候需要將陰極和陽極倒置才可以電泳分離堿性蛋白。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1、電泳儀、電泳槽、離心機(jī)等2、 丙烯酰胺、Tris、HCI、溴酚藍(lán)、ABTS等四、實(shí)驗(yàn)步驟1、PAGE膠電泳緩沖液配置1) 丙烯酰胺單體貯液：14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'-甲叉雙丙烯酰胺， 先用40mL 雙蒸水?dāng)嚢枞芙?，直到溶液變成透明，再用雙蒸水稀至50mL，過濾。用棕色瓶4°C保存?zhèn)溆谩?) 濃縮膠緩沖液貯液(0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8) : 3.03gTris溶解在40mL雙蒸水中，用 4mol/L鹽酸調(diào)pH6.8。再用雙蒸水稀至 50mL。保存在4

4、6;C備用。3) 分離膠緩沖液貯液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.9) : 18.16gTris溶解在80mL雙蒸水中，用 4mol/L鹽酸調(diào)pH8.9。再用雙蒸水稀至 100mL，保存在4°C備用。4) 10 %( AP)過硫酸銨：0.1g過硫酸銨溶入1.0mL雙蒸水，使用前新鮮配制。5) 電極緩沖液(0.025mol/L Tris, 0.2mol/L 甘氨酸，pH8.3): 15.14gTris 加上 72.07g 甘氨 酸，用雙蒸水稀釋到 5L?？稍谑覝乇４嬉粋€(gè)月。6) 樣品緩沖液(O.1mol/L Tris-HCl , pH6.8) : 2ml濃縮膠緩沖液貯液加

5、上1mL87%甘油、0.1mg溴酚藍(lán)，用雙蒸水稀釋至10mL，可在-20 °保存6個(gè)月。2、活性PAGE配方分離膠：雙蒸水6.6ml30%丙烯酰胺溶液8.0ml1.5mol/L Tris(pH8.8)5.0ml10%AP(W/V)200 TTEMED15円濃縮膠: 雙蒸水30%丙烯酰胺溶液1 mol/LTris(pH6.8) 10%過硫酸銨(W/V) TEMED6.8ml1.7ml1.25ml10i|100川3、活性PAGE電泳將玻璃板、膠墊、梳子用雙蒸水洗干凈，用酒精棉球擦拭，將電泳槽安裝好，配制分 離膠(12%)和濃縮膠(5%)如表1。過硫酸銨和 TEMED最后加入，加入后聚合即

6、開始， 應(yīng)立即混勻倒入兩塊玻璃板之間。分離膠倒入兩塊玻璃板間，應(yīng)該留下適合的高度，使點(diǎn)樣孔前端離分離膠有 2.5cm左右的距離，在膠頂部緩緩加入約 0.5cm高的雙蒸水，待 分離膠聚合完全后， 傾去上層的雙蒸水， 用雙蒸水清洗凝膠頂層， 用吸水紙吸去殘余的 水滴。將濃縮膠倒入玻璃板夾層，插上梳子，待濃縮膠聚合完全后，拔去梳子，立即用 雙蒸水清洗點(diǎn)樣孔。加入電極緩沖液，將樣品用微量進(jìn)樣器點(diǎn)入點(diǎn)樣孔底部，200伏電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠時(shí)，電壓改為250伏，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部。將凝膠剝下，浸泡在100ml的底物液中，染色 1小時(shí)，待膠帶顯色后立即照相。然后將凝 膠進(jìn)行常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)染色

7、。五、結(jié)果與分析記錄和觀察電泳過程中的溫度變化，電泳完后進(jìn)行活性染色時(shí)凝膠有色條帶的變化。對(duì) 比活性染色和常規(guī)的考馬斯亮藍(lán)染色后凝膠中蛋白質(zhì)條帶的變化。六、Native-PAGE注意事項(xiàng)1. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，蛋白質(zhì)的遷移率不僅和蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有關(guān)，還和蛋白質(zhì)的分子量以及分子形狀有關(guān)，其中蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)是最重要的影響因子，要根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來選擇對(duì)應(yīng)的電泳緩沖系統(tǒng)；2. 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的過程中，要注意電壓過高引起發(fā)熱而導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，所以最好在電泳槽外面放置冰塊以降低溫度；3. 蛋白質(zhì)的分子量較大，則電泳時(shí)間可以適當(dāng)延長，以使目的蛋白質(zhì)有足夠的遷移率 和其它的蛋白質(zhì)分開，反之亦然 ；4. 變性樣品的離子強(qiáng)度不能太高(