青枯菌無(wú)致病力菌株對(duì)煙草青枯病的控病作用初步研究_圖文

1、的 , 不是在實(shí)驗(yàn)室侵染所致 。 經(jīng)初步試驗(yàn)觀察 , 分生孢子在老葉上雖然能較好地萌發(fā) , 但不能形成附著 胞 , 所以 , 不能侵染老葉 , 茶園中老葉上的病斑一般 都是由成葉上病斑遺留下來(lái)的 。 3. 3 綜合治理根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和病原菌的生物學(xué)特性 1, 8, 結(jié) 合當(dāng)前的無(wú)公害茶葉生產(chǎn)考慮 , 對(duì)于該病的防治應(yīng) 采用控制病原菌為主的措施 。 最好在深秋除去茶樹(shù) 老葉中的病葉 , 并清理茶園中的落葉 , 旨在控制越冬 菌源 。 春季的定期采摘對(duì)控制該病的流行具有明顯 的作用 。 病害特別嚴(yán)重的茶園可在深秋封園時(shí) , 在 采用上述措施的基礎(chǔ)上 , 每隔 23年噴 1次石硫合 劑或波爾多液 9。

2、參考文獻(xiàn)1 陳宗懋 , 陳雪芬 . 茶樹(shù)病害的診斷和防治 M .上海 :上?？萍汲霭嫔?,1990.2 安徽農(nóng)學(xué)院 . 茶樹(shù)病蟲(chóng)害 M .北京 :農(nóng)業(yè)出版社 ,1993. 3 高旭暉 . 茶樹(shù)病害研究法 J.茶業(yè)通報(bào) , 1993(2 :26228. 4 方中達(dá) . 植病研究法 M .北京 :中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 ,1997. 5 Matosupono M. Some factors influenced t he tea resistance toblister blight C Proceedings of t he International Symposium on Tea Science.

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4、京 :農(nóng) 業(yè) 出 版社 ,1979.8 譚濟(jì)才 , 葉恭銀 , 高旭暉 , 等 . 茶樹(shù)病蟲(chóng)防治學(xué) M .北京 :中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 ,2002.9 陳雪芬 , 陳宗懋 . 茶園農(nóng)藥應(yīng)用技術(shù) M .北京 :化學(xué)工業(yè)出版社 ,2001.收稿日期 : 2007208201 修訂日期 : 2007210212基金項(xiàng)目 : 重慶市煙草公司資助項(xiàng)目 3通訊作者 E 2mail :chgxiao . cn青 枯 菌 無(wú) 致 病 枯 病 的研 究1, 肖崇剛 13, 鄒 陽(yáng) 2, 袁希雷 1(1. 西南大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 , 重慶 400716; 2. 云南省楚雄州煙草公司武定縣分公司 651600

5、摘要 從茄子 、 番茄 、 辣椒 、 煙草青枯病株中分離出 116株無(wú)致病力青枯菌 , 室內(nèi)平板噴霧法拮抗試驗(yàn)結(jié)果表明 , 有21株菌在 NA 培養(yǎng)基上可明顯抑制青枯菌 TbRs 的生長(zhǎng) ; 煙草 MSK326品種溫室盆栽控病試驗(yàn)表明 , Tmjd123和 Aujd82221兩株菌具有較好控病效果 ,20d 后的相對(duì)防效分別為 58. 4%和 97%。關(guān)鍵詞 煙草 ; 青枯病菌 ; 無(wú)致病力菌株 ; 防效 中圖分類號(hào) S 435. 72; S 476. 1A preliminary study on the control of tobacco bacterial wilt by avirul

6、entstrains of Ralstonia sol a nacea r umXiao Tian 1, Xiao Chonggang 1, Z ou Yang 2, Yuan Xilei 1(1. College of Plant Protection , S outhwest Universit y , Chongqing 400716, China; 2. Chux iong Tobacco Com pany W uding B ranch , Yunnan 651600, China Abstract A total of 116avirulent strains of Ralston

7、ia solanacearum were obtained f rom the stems of eggplants , to 2matos , capsicum and tobacco that were affected by this pathogen. I n vit ro antagonistic assay by spraying indicated that 21of the strains significantly inhibited the growth of R. solanacearum TbRs on NA media. In a disease 2control e

8、xperiment with tobacco MSK326carried out in greenhouses , two isolates (Tmjd123and Aujd82221 gave satisfacto 2ry results , with 58. 4%and 97%relative control rates , respectively. K ey w ords tobacco ; Ralstonia solanacearum ; avirulent strain ; efficacy 煙草青枯病是由勞爾氏菌屬的茄假單胞桿菌(R alstoni a sol anacearum

9、 引起的熱帶 、 亞熱帶地區(qū)97 研 究 報(bào) 告 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008 煙草的重要病害 , 是一種典型的維管束病害 , 一旦 發(fā)病即可造成全株死亡 , 對(duì)煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量影響 極大 , 是煙草上一大毀滅性病害 1。目前對(duì)煙草青 枯病的防治 , 仍無(wú)十分有效的措施 2。生物防治具 有無(wú)公害 、 無(wú)環(huán)境污染和防治作用專化性等優(yōu)點(diǎn) , Okabe 在 1954年首次發(fā)現(xiàn)青枯菌株之間有拮抗作 用后 , 國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者開(kāi)展了利用無(wú)致病力青枯菌 防治植物青枯病的研究工作 3。 A. Trigalet 等發(fā) 現(xiàn)誘變產(chǎn)生的無(wú)致病

10、力青枯菌突變株 GM I1229能 在番茄莖 、 葉部定殖 , 可阻止致病菌的增殖 , 并表 現(xiàn)有一定誘導(dǎo)抗性 , 具有較好的生物防治前景 4。 陳慶河用紫外誘變法獲得兩株無(wú)致病力菌株 , 研究 發(fā)現(xiàn)這兩株菌也能在番茄體內(nèi)定殖 , 經(jīng)盆栽試驗(yàn)表 明 ,20d 后對(duì)番茄青枯病防效可達(dá) 50%以上 5。 本文探索了從 4種茄科植物上分離得到的無(wú)致病 力青枯菌株對(duì)煙草青枯病的生防潛能 。1 材料與方法1. 1 供試材料試驗(yàn)煙草品種 ,提供。 指示菌 TbRs , 由本實(shí)驗(yàn)室提 供。 固體培養(yǎng)基為 NA , 致病性測(cè)定培養(yǎng)基為 TTC , 液 體培養(yǎng)基為 NB , 配方詳見(jiàn) 植病研究方法 第 3版 6

11、。 1. 2 青枯菌的采集和分離在重慶北碚區(qū) , 江津市 , 涪陵縣等地采集番茄 、 茄 、 辣椒 、 煙草青枯病病株 。兩種分離方法 , 具體參照文獻(xiàn) 7。青枯致病菌 株和無(wú)致病力菌株的區(qū)別參照方中達(dá)的方法 6。純 化后 , 將長(zhǎng)出的單菌落用移植環(huán)蘸取放入盛有無(wú)菌 水 的 試 管 , 采 用 比 濁 法 使 菌 懸 液 的 濃 度 達(dá) 到 3×108cf u/mL , 加塞放于 25 條件下保存 。 1. 3 無(wú)致病力菌株的鑒定通過(guò)鞭毛染色鑒定 , 準(zhǔn)備干凈光滑無(wú)痕紋的載 玻片 , 用新鮮制備的 NA 培養(yǎng)基活化菌株 , 制備染 劑 ,1824h 進(jìn)行鞭毛染色并鏡檢 12。1. 4

12、 平板篩選試驗(yàn)初篩 :采用噴霧法 8, 將指示菌 TbRs 涂在 NA 平 板上擴(kuò)大培養(yǎng) , 次日將獲得的無(wú)致病力菌株接種到 NA 平板上活化 , 然后每皿接菌 34位點(diǎn) ,2次重復(fù) , 培養(yǎng) 6h 后 , 將已培養(yǎng)好的指示菌配成 3×108cfu/mL 菌懸 液 , 裝入無(wú)菌的喉頭噴霧器中 , 將其均勻的噴在點(diǎn)接了 待測(cè)菌的平板上 , 每皿噴霧約 0. 2mL ,28 培養(yǎng) ,48h 后觀察是否有抑菌圈形成 , 并記錄觀察結(jié)果。復(fù)篩 :方法與初篩相同 , 將初篩時(shí)有抑菌圈的菌 種接種到 NA 平板的中心位置 , 每個(gè)菌株 3次重復(fù) , 方法同初篩 ,48h 后采用十字交叉法測(cè)量抑菌

13、帶寬 , 并記錄測(cè)量結(jié)果 。含菌培養(yǎng)基法 9:將復(fù)篩出的抑菌帶寬 1cm 的菌株采用噴霧法與含菌培養(yǎng)基法進(jìn)行平板篩選比 較 。 噴霧法同初篩 。 將指示菌 TbRs 及待測(cè)菌株轉(zhuǎn) 移到 NA 平板上活化 , 并擴(kuò)大培養(yǎng) , TbRs 配成 3×108cf u/mL 的菌懸液 , 與約 45 的 NA 培養(yǎng)基按 1 10混合 ,1h 后在平板中心接入待測(cè)菌株 , 每個(gè)菌 株 3次重復(fù) ,28 培養(yǎng) ,48h 后測(cè)量抑菌帶寬 , 方法 同復(fù)篩 , 并記錄測(cè)量結(jié)果 。1. 57:NA 平 , 配成 3×108cf u/mL 菌懸液 , 3片葉齡的煙草苗從土壤中撥出 , 洗凈根部土

14、 壤 , 分別浸泡在相應(yīng)的菌懸液中 , 對(duì)照浸水 , 浸泡 2h , 每處理 12株 , 然后移栽到塑料缽 。 15d 后傷根 灌接活性菌株發(fā)酵液 , 濃度調(diào)整為 3×108cf u/mL , 每株苗灌 5mL ,48h 后再灌 1次 ,48h 后同法接種 指示菌 TbRs 菌懸液 , 設(shè)置 3個(gè)對(duì)照 ,C K 空 灌無(wú)菌 水 ,C K Rs 灌指示菌 , C K X 灌待測(cè)菌株發(fā)酵液 。放于 28 的溫室中 , 在接種后 3d 開(kāi)始觀察并記錄結(jié)果 。 復(fù)測(cè) 10:將初測(cè)防治效果好的菌株進(jìn)行復(fù)測(cè) 。 方法與初測(cè)類似 , 煙草苗菌懸液浸根后移栽 , 每處理 10株 ,3次重復(fù) 。待煙苗

15、生長(zhǎng) 20d 后 , 傷根灌接復(fù) 測(cè)菌株發(fā)酵液 , 每株 5mL ,5d 后再灌 1次 , 第 2次 處理 48h 后 , 同法接種指示菌 TbRs , 放于 28 的 溫室中 , 出現(xiàn)病株后連續(xù)觀察 , 并記錄結(jié)果 。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為 11:0級(jí)為無(wú)癥狀 ;1級(jí)為植株 開(kāi)始出現(xiàn)萎蔫癥狀 , 莖部出現(xiàn)短條黑斑 ;2級(jí)為植物 50%的葉片萎蔫 , 莖部有較大黑斑 ;3級(jí)為煙株葉片 除頂葉 23片葉外 , 全部萎蔫 , 莖部黑斑長(zhǎng)而寬 ;4級(jí)為全株葉片萎蔫 , 莖大部變黑 。2 結(jié)果與分析2. 1 無(wú)致病力菌株鑒定結(jié)果鏡檢觀察結(jié)果表明 (圖 1 , 試驗(yàn)中篩選出菌株 菌體短桿狀 , 兩端鈍圓 , 單

16、極鞭毛 13根 , 與青枯菌 0 8 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008研 究 報(bào) 告菌體形態(tài)描述相符 。 圖 1 青枯菌無(wú)致病力菌株鞭毛染色結(jié)果2. 2 無(wú)致病力菌株平板篩選結(jié)果據(jù)方中達(dá)的方法區(qū)分青枯致病菌株和無(wú)致病力 菌株 6, 從采集的 184份樣本上直接分離得到菌株 138株 , 其中無(wú)致病力菌株 116株 , 致病菌株 22株 ,將無(wú)致病力菌株進(jìn)行平板篩選 , 菌活性的菌株共 63株 。 抑菌帶寬 >1株 , 抑菌帶寬最大是 TbW1, 23為 1. 38cm , ; 0. 51cm 的菌株 12, <0

17、. 5cm 的菌株 30株如表 1。將抑菌帶寬 >1cm 的菌株 Tmjd123采用噴霧法和含菌培養(yǎng)基兩種篩選方法比較 , 結(jié)果 如圖 2。 對(duì)于同一個(gè)菌株 , 采用噴霧法得到的抑菌 帶寬普遍大于含菌培養(yǎng)基法得到的 , 只有 Tmt32221、 Tb YYk121兩個(gè)菌株是例外 , 說(shuō)明這兩個(gè)菌株對(duì)指示菌可能具有溶菌作用 。從圖 3看出 , 噴霧法中部分菌株的抑菌帶寬小于 1cm , 與第 1次復(fù)篩的結(jié) 果不 一致 , 它們 是 Au00422、 Aujd522、 Tb YYk121、 TbW223、 TbW12721, 說(shuō)明這些菌株的抑菌活性不穩(wěn)定性 , 抑菌作用開(kāi)始衰退 (圖 3 。

18、圖 2 青枯菌無(wú)致病力菌株平板篩選的 1. Tm00222; 2. Tm00222r ; 3. Tm22221; 4. Tm7; 5. Tm12; 6. Tmt32221;7. Tmjd123; 8. Au00421; 9. Au00422; 10. Au 2jd321; 11. Aujd522; 12. Aujd82221; 13. Aujd102221; 14. Au 2jd102222;15. Aujd112124;16. Ll124;17. L623;18. Tb YYk121;19. TbW223;20. TbW12721;21. TbW12722圖 3 Tmjd123菌株對(duì)煙草青枯

19、菌的抑制作用表 1 青枯菌無(wú)致病力菌株平板篩選結(jié)果抑菌帶寬度 /cm菌株數(shù)量 /株菌株名稱 >121T m00222、 T m22221、 T m7、 T m12、 T mt 32221、 T mjd123、 Au00421、 Au00422、 Aujd321、 Aujd522、 Aujd82221、 Aujd102221、 Aujd102222、 Aujd112123、 Aujd112124、 Ll124、 L623、 Tb YYk121、 TbW223、 TbW12721、 TbW12722;0. 5112Tm10、 Aujd322、 Aujd523、 Aujd112122、 Ll1

20、21、 L522、 L422、 Tb YY 1、 Tb YY 7Tb YYn2、 TbW324、 Tb YYk123; <0. 530Tm00221、 Tm00622、 Tm121、 Tm8、 Tm11、 Tm13、 Tmt12221、 Tmt12223、 Tmt32121、 Tmt32122、 Tmjd12721、 Tmjd12722、 Tmjd223、 Tmjd225、 Aul22121、 Aul22122、 Aul221、 Aujd121、 Aujd122、 Aujd421、 Aujd422、 Aujd521、 Aujd62222、 Aujd1021、 Aujd1122、 Tb Y

21、Y n121、 Tb YYk12221、 Tb YY k221、 Tb YYk2222. 3 溫室控病試驗(yàn)結(jié)果將抑菌帶寬 >1cm 的菌株 (21株 進(jìn)行溫室控 病試驗(yàn) , 在初次測(cè)定的結(jié)果中 , 測(cè)定的大部分菌株能 夠推遲 7d 左右發(fā)病 , C K X 只灌接待測(cè)菌株的煙草 苗未表現(xiàn)異常 。測(cè)定結(jié)果如表 2。 20d 后 16株的相對(duì)防效均大于 60%, 其中 Au00421、 Aujd82221、 Tmjd123、 L623、 Tb YYk121的相對(duì)防效大于 80%,1株的相對(duì)防效為 40%60%, 只有 4株的相對(duì)防效 小于 40%。 根據(jù)菌株在 NA 培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)勢(shì)及 溫室

22、控病試驗(yàn)初測(cè)結(jié)果 , 將 Tmjd123、 Aujd82221兩18 研 究 報(bào) 告 第 34卷第 2期 (2008PLAN T PRO TECTION Vol. 34No. 2(2008 個(gè)菌株進(jìn)行溫室控病復(fù)測(cè) , 結(jié)果如表 3。 20d 后 Tmjd123對(duì)煙草青枯病的相對(duì)防效為 58. 4%,Au 2jd82221的為 97%。表 2 青枯菌無(wú)致病力菌株溫室控病 20d 后的初測(cè)結(jié)果防效 /%菌株數(shù)量 /株編號(hào) <404T m22221、 T m12、 TbW223、 TbW1272140601Tm00222r >6016Au00421、 Au00422、 Aujd321、

23、Aujd522、Aujd82221、 Aujd102221、 Aujd102222、 T mt 32221、 Aujd112124、 T mjd123、 T m7、 T m00222、 Ll124、 L623、 TbYYk121、 TbW12722表 3 青枯菌無(wú)致病力菌株溫室控病 20d 后的復(fù)測(cè)結(jié)果 1處理發(fā)病數(shù)/株病株率/%病情 指數(shù)相對(duì)防 效 /%CK 空 0000CK Rs 30100. 050. 00Tmjd123933. 320. 858. 4Aujd82221310. 02. 597. 1 各處理供試盆栽植株均為 30株。3 討論, 從 198株中 篩選到防效較好的 2株菌72

24、8, 本試驗(yàn)采用青枯菌不同寄主分離篩選對(duì)煙草青枯菌有防效的無(wú)致病力菌 株 , 從 116株中篩到 2株理想菌 , 相對(duì)比較容易獲得 理想菌株 , 原因可能是來(lái)自不同寄主的無(wú)致病力菌 株 , 與原寄主在協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中 , 產(chǎn)生了相關(guān)物質(zhì) , 而這些物質(zhì)對(duì)煙草青枯菌可能具有更強(qiáng)的抑制作 用 。 試驗(yàn)中對(duì)平板篩選出的抑菌效果較好的菌株進(jìn) 行了兩種平板篩選方法的比較 , 噴霧法抑菌帶寬普 遍大于含菌培養(yǎng)基法 。究其原因 , 可能主要由于噴 霧法先接種活性菌 , 有利于抑制煙草青枯菌的活性 物質(zhì)的產(chǎn)生和積累 , 而含菌培養(yǎng)基法同時(shí)接種活性 菌及煙草青枯菌 , 活性物質(zhì)的產(chǎn)生和積累比噴霧法 相對(duì)滯后 。

25、有兩個(gè)菌株的情況相反 , 說(shuō)明它們對(duì)煙 草青枯菌可能還具有溶菌作用 。 通過(guò)兩種方法的比 較 , 作者認(rèn)為 , 噴霧法比含菌培養(yǎng)基法操作簡(jiǎn)便 , 快 捷 , 適用于平板篩選試驗(yàn) 。建議可在溫室控病試驗(yàn) 后 , 再對(duì)最終篩選出防效較好的菌株進(jìn)行含菌培養(yǎng) 基法等相關(guān)平板抑菌試驗(yàn) , 以便為探討活性菌株的 控病作用機(jī)制提供更多依據(jù) 。試驗(yàn)結(jié)果表明 , 對(duì)煙草青枯菌平板抑菌作用強(qiáng) 的菌株 , 溫室控病效果不一定好 , TbW12721的平板 抑菌作用最強(qiáng) , 但是溫室控病效果不理想 , 初測(cè) 7d 后相對(duì)防效為 50%, 20d 后無(wú)防效 。 Tmjd123和 Aujd82221平板抑菌作用幾乎無(wú)差別

26、 , 但是溫室控病作用差異大 , 說(shuō)明無(wú)致病力菌株對(duì)煙草青枯菌的平 板抑菌作用強(qiáng)弱與溫室控病效果好壞不存在正相 關(guān) , 這與前人研究的結(jié)果相同 7。說(shuō)明無(wú)致病力菌 株對(duì)煙草青枯菌的控病作用 , 除了與菌株本身產(chǎn)生 的抑菌活性物質(zhì)相關(guān)外 , 還與菌株是否能在寄主上 定殖 , 與致病菌位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)能力以及是否誘導(dǎo)寄主抗 性等因素相聯(lián)系 。 本試驗(yàn)中篩選出溫室控病防效較 好的菌株 , 對(duì)于其具體的控病作用機(jī)制 , 以及其他無(wú) 體外抑菌活性的菌株 , , 。1 朱賢朝 , 王彥亭 , 王智法 . 中國(guó)煙草病蟲(chóng)害防治手冊(cè) M .北京 :中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社 ,2003.2 孔凡玉 . 煙草青枯病的綜合防治 J.煙草科技 ,2003,