產(chǎn)enterocin E5細(xì)菌素糞腸球菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

1、基金項目：北京市農(nóng)委課題，北京市教委課題，2011年度科技面上項目作者簡介：崔德鳳，女，1963年生，高級實驗師，研究方向為動物微生物學(xué)與免疫學(xué)，E-mail:*通訊作者：張永紅產(chǎn)enterocin E5細(xì)菌素糞腸球菌發(fā)酵條件的優(yōu)化崔德鳳1，周波1，楊桂梅1，李煥榮1，阮文科1汪明2張永紅1 *(1.北京農(nóng)學(xué)院 動物科技學(xué)院, 北京昌平102206；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院, 北京100193)摘要：目的對產(chǎn)enterocin E5細(xì)菌素糞腸球菌的發(fā)酵條件進(jìn)行研究。方法采用瓊脂擴散法測定發(fā)酵上清液對大腸埃希菌K88的抑菌活性。結(jié)果確定糞腸球菌E5產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件為MRS培養(yǎng)基，最適溫度為3

2、7，最適起始pH值6.5，最佳接種量2%,種齡14 h，發(fā)酵時間16h,最佳培養(yǎng)基組分氮源為1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉，最佳碳源為1%葡萄糖、0.5%蔗糖, 0.1% Tween-80有利于enterocin E5的產(chǎn)生。這是分離自北京優(yōu)良商品豬黑六產(chǎn)enterocin E5糞腸球菌的首次報道。關(guān)鍵詞enterocin E5；糞腸球菌；發(fā)酵條件；抗菌活性Study on the optimum enterocin E5 production condition of Enterococcus faecalisE5CUI Defeng1 ,Zhou bo YANG Guimei1 , LI

3、Huanrong1 ,RUAN Wenke1 ,WANG Ming2 , ZHANG Yonghong1*( 1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China ; 2.College of Veterinary Medicine , China Agricultural University , Beijing 100193 , China)AbstractObjectiveTo investigate the fermen

4、tation conditions for growth and antibacterial substance production by Enterococcus faecalis E5.MethodThe antibacterial activity of the supernatant against Escherichia coli K88 was tested with agar well diffusion. ResultsThe optimum fermentation conditions for E5 to produce enterocin E5 included the

5、 following: tryptone 1%, yeast extract 0.5%, glucose1%,sucrose 0.5%, and Tween-80 0. 1%.This formula of modified MRS could stimulate the generation of enterocin E5.The optimum initial pH was 6.5,while the best temperature was 37,with the inoculation amount of 2% (v/v), the seed age of 14 h,and the f

6、ermentation period of 16 h. This is the first report on enterocin E5 produced by Enterococcus faecalisE5 isolated from Beijing black six swine.Key words enterocin E5; Enterococcus faecalis;Fermentation conditions; antibacterial activity 乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一類能夠發(fā)酵糖產(chǎn)生大量乳酸細(xì)菌的統(tǒng)稱，腸球菌（enterococci）是乳

7、酸菌中對營養(yǎng)要求不高、容易培養(yǎng)、分布廣泛的一類革蘭氏陽性球菌。長期以來在乳制品加工、蔬菜及肉制品的發(fā)酵工藝中廣泛應(yīng)用。腸球菌在生長繁殖過程中除產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機酸外還能產(chǎn)生多種具有抑菌或殺菌活性的細(xì)菌素，在抑制多種動物源病原微生物和食物腐敗菌等方面具有重要作用。 (Abriouel, Ben Omar 等， 2006)從食品中分離出產(chǎn)生enterocin P細(xì)菌素的腸球菌并對其特性進(jìn)行了深入的研究3。分離自牛糞堆肥中的腸球菌顯示出對食物源病原微生物和腐敗菌的抑制活性2。(Siragusa, 1992)從牛的胃腸道分離的希氏腸球菌對李斯特菌屬具有明顯的抑菌活性23。還有分離自扁角鹿、雞腸道、鴕

8、鳥腸道、小型豬糞便等動物源和分離自青貯飼料、乳酪發(fā)酵劑、西班牙發(fā)酵橄欖，意大利臘腸等食物源腸球菌細(xì)菌素的報道4, 8,10,14,15,18, 25,26。細(xì)菌素的合成受到很多因素的影響，其中包括培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)基初始pH值、培養(yǎng)溫度、收獲時間、保存條件等等21。實驗證明來源于鵪鶉盲腸的腸球菌產(chǎn)細(xì)菌素活性最強的培養(yǎng)基是ZAL13。研究發(fā)現(xiàn)pH和葡萄糖對Enterococcus faecium P13產(chǎn)生enterocin P的影響，細(xì)菌生長和葡萄糖消耗在pH7.0時達(dá)到最大值，細(xì)菌素的活性呈pH依賴性，pH恒定調(diào)節(jié)為6.0時，獲得最大抑菌活性9。從細(xì)菌素應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)學(xué)角度出發(fā)，研究細(xì)菌素產(chǎn)生菌

9、發(fā)酵動力學(xué)，細(xì)菌素與產(chǎn)生菌的作用方式，影響細(xì)菌素產(chǎn)量的因素等具有極其重要作用。產(chǎn)生enterocin E5細(xì)菌素的腸球菌從北京健康商品豬黑六胃腸道分離鑒定，具有廣譜的抑菌活性，編碼enterocins A結(jié)構(gòu)基因。本研究擬對影響enterocin E5生產(chǎn)條件，如培養(yǎng)基組成、pH值、培養(yǎng)溫度等進(jìn)行全面研究。1材料1.1菌株糞腸球菌E5：由微生物實驗室分離篩選的產(chǎn)細(xì)菌素菌株；指示菌：大腸桿菌K88由微生物實驗室保存1.2 培養(yǎng)基MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g酵母浸粉5g葡萄糖10g蔗糖5g醋酸鈉15g枸櫞酸銨2gKH2PO4 6g MgSO4.7 H20 0.58g，MnSO4.4H20 0.25

10、g，F(xiàn)eSO4.7 H20 0.03g，吐溫-80 1g蒸餾水1 L pH7.0-7.4。PYG培養(yǎng)基：大豆蛋白胨 0.5g酵母浸粉0.5gKH2PO4 0.1g葡萄糖 0.1g MgSO4.7 H20 0.02g MnSO4.4 H20 0.002g蒸餾水0.1 L pH6.5。2方法2.1糞腸球菌E5生長曲線與抑菌活性的測定將培養(yǎng)12h糞腸球菌E5種子液以1的接種量接種于250 ml MRS培養(yǎng)基中，37 培養(yǎng)48h，每隔2小時取發(fā)酵培養(yǎng)液以未接種的培養(yǎng)液作為空白對照，細(xì)菌密度的測定， 采用UN1C0 UV-2000型分光光度計測OD600，pH值采用EUTECH pH510型酸度計測定。

11、同時410000 rmin離心10min，取上清采用瓊脂擴散法測定其抑菌圈直徑(mm)，指示菌為大腸桿菌K88。2.2培養(yǎng)基及其組份對enterocin E5產(chǎn)生的影響接種糞腸球菌E5種子液于TSB，SM，MRS和APT四種發(fā)酵培養(yǎng)基中37靜止培養(yǎng)24h，測定發(fā)酵液的OD600值、pH值及抑菌效價；以有機氮和無機氮（蛋白胨、胰蛋白胨、大豆蛋白胨，檸檬酸銨、硝酸鈉代替確定培養(yǎng)基中的氮源成分，以蔗糖、乳糖、阿拉伯糖等常用碳源對確定培養(yǎng)基中的葡萄糖進(jìn)行等量替換，檢測發(fā)酵液的OD600值、pH值及抑菌效價；在培養(yǎng)基中添加0.1-1%Tween-80，以1% ( v /v) 種子液進(jìn)行接種，37需氧培養(yǎng)

12、24h測定菌體密度OD600和發(fā)酵上清液的抑菌效果，確定Tween-80的用量。 2.3培養(yǎng)基起始 pH值的確定 用1mol/L的HCI或1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的pH值至4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0接種腸球菌E5 37培養(yǎng)48 h ，測定菌體生長密度OD600與細(xì)菌素抑菌活力。 2.4最適培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式的確定將接種糞腸球菌E5的MRS培養(yǎng)基分別在20、25、30、37和42培養(yǎng) 24h，以最適培養(yǎng)溫度選擇振蕩和靜止的方式培養(yǎng)24h，測定細(xì)菌生長密度OD600和抑菌效果。2.5接種細(xì)菌種齡、接種量的確定分別將不同種齡(6、8、

13、10、12、14、16、18、20、22、24h)的糞腸球菌E5種子液按1%的接種量接入MRS培養(yǎng)基中37培養(yǎng)48 h ，測定菌體密度OD600與抑菌效果。取最適種齡糞腸球菌E5菌液以1.0%-10%接種量進(jìn)行接種，37培養(yǎng)24h，測定菌體密度OD600和上清液的抑菌效果。3 結(jié)果與分析3.1糞腸球菌E5生長曲線與抑菌活性的測定糞腸球菌E5在培養(yǎng)2h、3h即進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)菌濃度呈指數(shù)式的增長，16-18h左右進(jìn)入穩(wěn)定期，細(xì)菌濃度增長速度緩慢，發(fā)酵2h后pH值顯著下降，發(fā)酵22h后pH值趨于穩(wěn)定，從整個發(fā)酵過程可以看出菌株產(chǎn)酸能力較強，最終pH值為4.5左右。糞腸球菌E5的抑菌活性曲線與細(xì)菌

14、生長動力學(xué)走勢基本相似。細(xì)菌培養(yǎng)2h可以檢測到enterocin E5細(xì)菌素，抑菌活性隨培養(yǎng)時間的變化情況類似于菌濃度OD600值的變化，在對數(shù)生長期細(xì)菌素開始產(chǎn)生，18h進(jìn)入穩(wěn)定期后細(xì)菌素產(chǎn)量緩慢增加，未觀察到細(xì)菌素產(chǎn)量的減少趨勢。通常認(rèn)為細(xì)菌素的產(chǎn)生與生長相關(guān)聯(lián)，有的細(xì)菌素在細(xì)胞開始生長時即可產(chǎn)生，而有的細(xì)菌素則在對數(shù)生長后期或穩(wěn)定期產(chǎn)生，在生長到一定時間后抑菌活性降低，可能是由于細(xì)菌素吸附到產(chǎn)生菌細(xì)胞表面導(dǎo)致發(fā)酵液中細(xì)菌素活性的下降，也可能是細(xì)菌素發(fā)生降解而失活20。圖1.不同時間下菌體密度與enterocin E5抑菌效果Fig. l Cell growth and enterocin

15、 E5 activity at different culture time 圖1.不同時間下菌體密度與enterocin E5抑菌效果Fig. l Cell growth and enterocin E5 activity at different culture time3.2 細(xì)菌素高產(chǎn)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化糞腸球菌E5在TSB，SM，MRS和APT四種培養(yǎng)基上均能夠生長，APT最有利于腸球菌株的菌體生長，SM 產(chǎn)生的菌體濃度最低，細(xì)菌素抑菌活性最小，MRS細(xì)菌素產(chǎn)量最大，其次依次為TSB、APT和SM，因此選取MRS作為糞腸球菌E5生產(chǎn)細(xì)菌素用培養(yǎng)基。3.2.1碳源對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響碳源

16、：分別采用乳糖、木糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖取代MRS中的葡萄糖成分，以1%（m/v）的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始pH 6.5、37培養(yǎng)48 h，測定菌體生長與抑菌圈直徑，結(jié)果見表1?？梢钥闯龀咎羌?xì)菌濃度較低外（因糞腸球菌E5不發(fā)酵木糖），其他幾種糖均能促進(jìn)細(xì)菌生長及細(xì)菌素的產(chǎn)生，培養(yǎng)液pH變化明顯，呈弱酸性，葡萄糖和蔗糖對細(xì)菌素的形成作用最明顯。表1 碳源成分對enterocin E5產(chǎn)量的影響Table1 Effects of carbon source on the production of enterocin E5碳源成分OD600抑菌圈直徑/cmpH葡萄糖1.91

17、1.894.5乳糖1.861.514.6蔗糖1.871.864.5甘露糖1.771.355.1麥芽糖1.741.464.6木糖1.131.026.5果糖1.691.325.03.2.2 氮源對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響分別用大豆蛋白胨、蛋白胨、檸檬酸銨和硝酸鈉替代MRS中的胰蛋白胨，按1%（m/v）的比例添加。以1%接種量接種種子液、起始pH 6.5、37培養(yǎng)48 h，測定菌體生長與抑菌圈直徑，結(jié)果見表2?？梢钥闯觯鹊鞍纂俗钣欣诩?xì)菌的生長及細(xì)菌素的產(chǎn)生，添加蛋白胨、大豆蛋白胨細(xì)菌素產(chǎn)量較低；無機氮源不能滿足細(xì)菌細(xì)胞生長需要與細(xì)菌素的生成，培養(yǎng)液pH值基本無變化。有機氮源的種類對細(xì)菌素的產(chǎn)生有較大影響

18、，不同來源的菌株對氮源的需要有所不同，細(xì)菌素產(chǎn)量也盡相同。表2 氮源成分對enterocin E5產(chǎn)量的影響Table2 Effects of nitrogen source on the production of enterocin E5氮源成分OD600抑菌圈直徑/cmpH胰蛋白胨1.921.774.5蛋白胨1.781.454.6大豆蛋白胨1.651.324.6硝酸鈉0.070.006.2檸檬酸銨0.490.006.03.2.3 Tween-80添加量對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響 Tween-80是一種表面活性劑，可以促進(jìn)細(xì)菌素的產(chǎn)生和抑菌活性的增強。實驗表明：當(dāng)Tween-80的添加量為1%時，

19、抑菌圈直徑為1.8cm，比不添加Tween-80的對照組（抑菌圈直徑1.62 cm)抑菌活性提高了10%。3.3 培養(yǎng)基初始pH值對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖1-2所示，培養(yǎng)基初始pH值對細(xì)菌素產(chǎn)量有較大影響，在初始pH 6.5時細(xì)菌素產(chǎn)量最大偏酸或偏堿都不利于細(xì)菌素的產(chǎn)生。細(xì)胞生長變化較小，在pH6.5時OD600達(dá)到最大值這也說明細(xì)菌素的產(chǎn)生與細(xì)胞生長呈正相關(guān)。圖2初始pH值對細(xì)菌素產(chǎn)生的影晌Fig 2 Effect of initial medium pH on the production of enterocin E53.4 不同培養(yǎng)溫度對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響分別將接種糞腸球菌E5的MRS

20、培養(yǎng)基置于不同的溫度 (20、25、30、37和42)培養(yǎng)24h ，測定菌體生長密度與抑菌圈直徑如表3所示。細(xì)菌最低生長溫度為20，最高生長溫度42，隨著溫度的升高，細(xì)菌密度不斷增加在37達(dá)到最大值，細(xì)菌生長最好，獲得最大細(xì)菌素活性單位。高于37，細(xì)菌生長密度明顯降低，這與資料報道的某些細(xì)菌素在低于最適培養(yǎng)溫度條件下有較高細(xì)菌素產(chǎn)量的結(jié)論不一致，說明細(xì)菌素的產(chǎn)生是一種復(fù)雜生理代謝過程，與多種因素有關(guān)。糞腸球菌E5在振蕩和靜止情況下都能生長，2種培養(yǎng)方式的菌體密度和抑菌效果差異不顯著。表3 培養(yǎng)溫度對enterocin E5產(chǎn)量的影響Table3. Effect of culture tempe

21、rature on the production of enterocin E5培養(yǎng)溫度菌體密度OD600抑菌圈直徑pH251.651.625.6301.711.565.2371.891.764.5421.681.555.13.5接種種齡、接種量對細(xì)菌素產(chǎn)量的影響不同種齡對菌體密度和細(xì)菌素抑菌效果的影響，結(jié)果顯示種齢10-14 h之間細(xì)菌素產(chǎn)量基本一致，種齡14 h菌體密度最高抑菌效果最明顯，16 h后菌體密度和發(fā)酵上清液的抑菌效果有降低的趨勢，圖略。最佳接種量的確定，隨著接種量的改變細(xì)菌素的抑菌效果變化很大，接種量2%-10%時菌體密度基本沒有太大變化，0.5%接種量細(xì)菌生長較慢，接種量2%

22、時抑菌效果最好可能2%接種量有利于細(xì)菌的快速生長和細(xì)菌素的分泌和積累，圖略。4 討論細(xì)菌產(chǎn)細(xì)菌素一方面由內(nèi)在的遺傳特性所決定，另一方面還會受到生長環(huán)境條件的限制，如營養(yǎng)(包括碳源和氮源)17、溫度、初始pH、生長刺激因子、培養(yǎng)方式以及其它代謝物都會影響細(xì)菌素的產(chǎn)量與活性。本實驗采用幾種常用乳酸菌培養(yǎng)基檢測細(xì)菌素活性，發(fā)現(xiàn)APT最有利于糞腸球菌E5株菌體的生長，但是MRS最適合細(xì)菌素的產(chǎn)生與積累，因此選取MRS為糞腸球菌E5細(xì)菌素生產(chǎn)用培養(yǎng)基。乳酸菌在細(xì)菌生長的過程中產(chǎn)生細(xì)菌素，培養(yǎng)條件刺激細(xì)菌細(xì)胞生長和細(xì)菌素的合成 6,16然而提高生長率和細(xì)菌菌體濃度對獲得滿意的細(xì)菌素水平并不是必需的，環(huán)境條

23、件完全可以影響特定細(xì)菌素的產(chǎn)生。即使細(xì)菌素產(chǎn)生菌生長很好，每個細(xì)胞合成多少細(xì)菌素，怎樣產(chǎn)生的都不能確定。在這種情況下，培養(yǎng)基的成分、最適pH、培養(yǎng)溫度等條件尤為重要。 為了探討細(xì)菌主要營養(yǎng)素碳源和氮源對菌體生長，菌株產(chǎn)細(xì)菌素能力的影響，按MRS培養(yǎng)基的碳源比例分別用蔗糖、乳糖、麥芽糖等常用碳源對原培養(yǎng)基中的葡萄糖作了等量替換，實驗證明糞腸球菌E5菌株的最適碳源為葡萄糖和蔗糖。此結(jié)果與大多數(shù)的細(xì)菌素產(chǎn)生菌的碳源需求相似，可能是因為乳酸菌具有一個磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)，承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖和蔗糖的運轉(zhuǎn)與伴隨的磷酸化代謝途徑。實驗分別以15g的有機氮源和無機氮源代替MRS培養(yǎng)基中的胰蛋白胨和酵母浸粉總量，結(jié)果表

24、明胰蛋白胨和酵母浸粉最有利于細(xì)菌素的生成。研究表明胰蛋白胨和酵母浸浸粉對乳酸乳球菌產(chǎn)生nisin有很大影響，兩種成分都能增加nisin 的產(chǎn)量，然而高濃度的胰蛋白胨會使nisin產(chǎn)量減少5。發(fā)現(xiàn)增加培養(yǎng)基中有機氮源的含量可以使微球菌GO5產(chǎn)生的micrococcin GO5的產(chǎn)量有很大提高，培養(yǎng)起始pH為7.0-9.0，最適溫度為37，在MRS組成中，乳糖和蔗糖更利于micrococcin GO5產(chǎn)12。有機氮源的種類對細(xì)菌素的產(chǎn)量也有影響，這可能與細(xì)菌素合成機制有關(guān)，某些氮源物質(zhì)成分誘導(dǎo)了細(xì)菌素基因的啟動24。Tween-80是一種表面活性劑，作為一種乳化劑，能夠降低細(xì)菌與玻璃器材之間的表面

25、張力，改善細(xì)菌素產(chǎn)生菌細(xì)胞膜的通透性，促進(jìn)細(xì)菌素的形成和活力的增強,但Tween-80過量，會影響硫酸銨反應(yīng)形成沉淀，使純化難度加大21。本實驗比較了添加Tween-80對細(xì)菌素產(chǎn)生的影響，確定1%的Tween-80有利于細(xì)菌素的形成。各種細(xì)菌素產(chǎn)生的最適溫度各不相同，這與細(xì)菌的種類與不同的來源有關(guān)。乳酸鏈球菌產(chǎn)生Nisin的最適溫度為305,而擴展短桿菌ATCC9175在25時類細(xì)菌素的產(chǎn)量最高，37細(xì)菌素產(chǎn)量不明顯19 。乳酸菌CCUG 42687合成Sakacin P最適溫度為20，在25-30細(xì)胞濃度低時，Sakacin P停止形成，培養(yǎng)溫度20時Sakacin P的產(chǎn)量是30時的7倍

26、，葡萄糖耗盡時，Sakacin P濃度非常低，酵母粉濃度增加，細(xì)菌細(xì)胞增長率增加，伴隨Sakacin P 產(chǎn)量增加，胰蛋白胨的濃度對Sakacin P也有正向影響1。而腸球菌RZS C5產(chǎn)細(xì)菌素的溫度必須控制在35 。本實驗中的糞腸球菌E5產(chǎn)enterocin E5細(xì)菌素的最適溫度為37，振蕩培養(yǎng)與靜止培養(yǎng)對細(xì)菌素的產(chǎn)生影響差異不顯著。糞腸球菌E5在細(xì)菌生長穩(wěn)定期后獲得最大抑菌活性細(xì)菌素，與大多數(shù)細(xì)菌素產(chǎn)生動力學(xué)相似。乳酸菌產(chǎn)生細(xì)菌素受許多因素制約，培養(yǎng)基起始pH值是影響細(xì)菌素合成的重要因素之一。(Egorov, Baranova 等， 1976)研究了培養(yǎng)基起始pH值4.0-6.6對乳鏈球菌

27、生長和nicin生物合成的影響，表明pH值4.0-4.5細(xì)菌生長較差，pH值4.0沒有觀察到nicin生物合成，培養(yǎng)基最適pH值為4.5-6.6。細(xì)菌素Nisin，在pH值偏酸性時，抑菌活性強；在pH值偏中性時，抑菌效果顯著下降7。不同的細(xì)菌素適用的pH范圍不同，大多數(shù)在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，作用效果也較好。但很多細(xì)菌素在中性或堿性條件下，抑菌活性減弱或喪失，如PediocniAcH、PediocinA、PediocinPA1、Uctaein、Lactaein27、Acidolin、Nisin和Diplococcin具有相似的特征，此現(xiàn)象可能是由于細(xì)菌素分子在堿性條件下降解造成的。本實驗中培養(yǎng)基在初

28、始pH 6.5時細(xì)菌素產(chǎn)量最大，偏酸或偏堿都不利于細(xì)菌素的產(chǎn)生。這一結(jié)果與細(xì)菌素的pH值生物學(xué)耐受性的特性相符22 。5 結(jié)論本文首次報道從北京優(yōu)良地方品種黑六豬胃腸道分離產(chǎn)enterocin E5糞腸球菌，并確定了最適培養(yǎng)條件為MRS培養(yǎng)基，起始pH值6.5、培養(yǎng)溫度37，接種量2%、種齡14 h，發(fā)酵時間16h，最佳培養(yǎng)基組分氮源為1%胰蛋白胨、0.5%酵母浸粉，最佳碳源為1%葡萄糖、0.5%蔗糖, 0.1% Tween-80有利于enterocin E5的產(chǎn)生。為enterocin E5作為抗菌制劑的研制奠定了理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)1. Aasen, I. M., T. Moretro, e

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