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1、實(shí) 驗(yàn) 植物光合與呼吸速率的測(cè)定紅外線CO2吸收法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康墓夂献饔檬堑厍蛏献钪匾纳F(xiàn)象,它是唯一能把太陽能轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化學(xué)能貯藏在有機(jī)物中的過程,是維持地球上物質(zhì)循環(huán)的關(guān)鍵環(huán)節(jié),也是農(nóng)作物產(chǎn)量形成的決定性因素。在植物科學(xué)研究中,經(jīng)常需要測(cè)定光合作用。在光合作用(及呼吸作用)測(cè)定方法的發(fā)展過程中,曾經(jīng)有過多次革新,其中包括測(cè)定干物質(zhì)積累的稱重法,測(cè)定CO2吸收(和釋放)的滴定法,測(cè)氧氣釋放的檢壓法和氧電極法等。與這些方法相比,紅外線氣體分析儀堪稱較先進(jìn)的方法。它不但快速、準(zhǔn)確,而且可將測(cè)定信號(hào)變?yōu)殡娦盘?hào)輸出,便于儀器的自動(dòng)化和智能化。一、實(shí)驗(yàn)原理紅外線CO2氣體分析儀(IRGA)工作原理
2、:當(dāng)紅外光經(jīng)過含有CO2的氣體時(shí),能量就因CO2的吸收而降低,降低的多少與CO2的濃度有關(guān),并服從朗伯比爾定律。即紅外線經(jīng)過 CO 2氣體分子時(shí),其輻射能量減少,被吸收的紅外線輻射能量的多少與該氣體的吸收系數(shù)( K )、氣體濃度( C)和氣體層的厚度( L )有關(guān),可以用下式表示: E = E 0 e -KCL 式中: E 0:入射紅外線的輻射能量; E:透過的紅外線的輻射能量。一般紅外線 CO 2 氣體分析儀內(nèi)設(shè)置僅讓 4.26m 紅外線通過的濾光片,其輻射能量即 E 0 ,只要測(cè)得透過的紅外線輻射能量( E )的大小,即可知 CO 2 氣體濃度。本實(shí)驗(yàn)中:IRGA 是測(cè)定 CO 2 濃度的
3、專用儀器,不能直接測(cè)定植物葉片的光合速率,必須根據(jù) IRGA的性能和測(cè)定目的,將 IRGA與同化室組成一定的氣路系統(tǒng),才能進(jìn)行葉片光合速率的測(cè)定。常用的氣路系統(tǒng)有密閉式和開放式兩種(本實(shí)驗(yàn)采用密閉式)。 1、密閉式氣路系統(tǒng):被測(cè)植物或葉片密閉在同化室中,不與同化室外發(fā)生任何的氣體交換,同化室內(nèi)的 CO 2濃度因光合作用而下降,或由呼吸作用而上升,可用 IRGA 測(cè)定同化室內(nèi) CO 2 濃度的下降值或上升,計(jì)算光合速率或呼吸速率。二、儀器 GXH-3051紅外線CO2氣體分析儀 氣泵開關(guān)電源開關(guān)調(diào)零旋鈕調(diào)零測(cè)量轉(zhuǎn)換旋鈕進(jìn)氣口出氣口圖3-3-1、GXH-3051紅外線CO2氣體分析儀閉路光合的工作
4、原理為:由兩根氣路管在葉室和紅外線CO2分析儀之間連通形成回路進(jìn)行氣體的循環(huán),在葉片的光合作用吸收CO2放出O2的過程中達(dá)到對(duì)CO2濃度降低的測(cè)量,從而計(jì)算出植物光合作用速率等數(shù)據(jù)。原理圖如下:顯示與調(diào)節(jié)葉 室紅外線分析儀氣體輸入氣體輸出光照?qǐng)D 閉路光合的工作原理圖 開路光合的工作原理為,由單根導(dǎo)氣管在紅外線CO2分析儀與葉室之間連通,形成開路。在開路光合測(cè)量時(shí),通入的氣體濃度必須是已知的(如P1=500ppm),當(dāng)數(shù)據(jù)采集完成后,讀出的數(shù)據(jù)(設(shè)為P2),那么由儀器讀數(shù)在光合作用前后的變化值就是植物光合作用所吸收的CO2的量(設(shè)為P光合)。即: P光合=P1-P2開路光合的光合速率測(cè)定公式為:
5、 式中各字母代表的參數(shù)與閉路光合時(shí)一樣,F(xiàn)代表氣體流量。工作原理圖如下穩(wěn)定氣源輸入葉 室顯示與調(diào)節(jié)紅外線 分析儀氣體輸出光照?qǐng)D 開路光合測(cè)量工作原理圖 三、實(shí)驗(yàn)材料甜菜和丁香等植物的葉片(活體)。四、實(shí)驗(yàn)步驟1、 按儀器使用說明書要求將氣路系統(tǒng)的各部分連接起來,打開氣室。2、 接通電源,打開紅外儀電源預(yù)熱15min,表頭顯示的數(shù)據(jù)為殘留在樣品室中的CO2的氣體濃度值。預(yù)熱過程中氣泵開關(guān)應(yīng)處在關(guān)閉的位置上。3、將儀器后面板的切換閥旋到左側(cè)的調(diào)零位置上,打開氣泵電源,約1min后,數(shù)顯表頭的顯示值趨向零點(diǎn)附近,調(diào)節(jié)紅外儀前面板“調(diào)零”旋鈕,顯示在“零點(diǎn)”位置。4、跨度校準(zhǔn):關(guān)上氣泵的開關(guān),將儀器后
6、面板的切換閥旋到右側(cè)的測(cè)量位置上,將標(biāo)準(zhǔn)氣以1.2L/min的流量與儀器的“進(jìn)氣口”相連,使標(biāo)準(zhǔn)氣通入儀器內(nèi),約1min左右,待顯示值穩(wěn)定以后,旋下跨度電位器上的保護(hù)蓋,調(diào)節(jié)跨度旋鈕使顯示CO2濃度與標(biāo)氣濃度一致。5、 將待測(cè)葉片放入同化室(氣室),密閉后當(dāng)CO2濃度穩(wěn)定下降時(shí),開始測(cè)定,讀取開始的CO2濃度值C1,開始計(jì)時(shí),CO2下降至C2(約下降2030ppm),終止計(jì)時(shí),記錄C1、C2、t(或確定從測(cè)定開始到結(jié)束所需時(shí)間),測(cè)定結(jié)束后測(cè)量葉片的面積(氣室面積)。6、 計(jì)算凈光合速率: 上式中,Pn光合速率(單位mol·m2·s1);CCO2濃度落差C1-C2(ppm:
7、uL/L);t測(cè)定時(shí)間(S);S葉片面積(單位m2);V同化室(包括氣路系統(tǒng))體積(單位L:0.07L);t同化室的溫度;P大氣壓(單位Mpa)。系統(tǒng)容積是閉路光合中很重要的一項(xiàng)參數(shù)。它的值包括了葉室體積、氣路管容積和紅外線分析儀里氣室容積的總合,即V系統(tǒng)容積=V葉室體積+V氣路管容積+V分析儀氣室容積該儀器的系統(tǒng)容積為0.07L。7、呼吸速率測(cè)定:葉室用遮光布(由紅、白、黑布疊縫而成)遮光。方法同上。 表1-1 植物光合速率呼吸速率測(cè)定記錄表植物材料葉片面積(m2)同化室體積V(L)同化室溫度t ()大氣壓P (Mpa)測(cè)定時(shí)間t(S)CO2濃度落差C(ppm:uL/L)0.07L光合速率P
8、n(mol·m2·s1)呼吸速率(mol·m2·s1)五、注意事項(xiàng)1、密閉系統(tǒng)的最基本要求是嚴(yán)格密閉,不能漏氣,否則無法測(cè)定。 2、紅外儀的濾光效果并不十分理想,水蒸氣是干擾測(cè)定的主要因素,因此,取樣器干燥管內(nèi)的 CaCl2要經(jīng)常更換,避免吸水溶解進(jìn)入紅外儀,污染分析氣室,以保證測(cè)量精度,延長(zhǎng)儀器壽命。3、實(shí)驗(yàn)期間,儀器使用后請(qǐng)立即充電,以確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)四 植物體過氧化物酶的測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆沼糜鷦?chuàng)木酚法測(cè)定過氧化物酶活性的方法。二、實(shí)驗(yàn)原理:過氧化物酶廣泛頒布于植物的各個(gè)組織器官中。在有過氧化氫存在下,過氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化,生成茶
9、褐色物質(zhì),可用分光光度計(jì)測(cè)量生成物的含量。三、實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備1、實(shí)驗(yàn)儀器722型分光光度計(jì)、離心機(jī)、秒表、電子天平、研缽2、實(shí)驗(yàn)試劑愈創(chuàng)木酚、30%過氧化氫、20 mmol/L KH2PO4、100 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)、反應(yīng)混合液100 mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0) 50mL,加入愈創(chuàng)木酚28uL,加熱攪拌,直至愈創(chuàng)木酚溶解,待溶液冷卻后,加入30%過氧化氫19uL,混合均勻保存于冰箱中。3、實(shí)驗(yàn)材料任何植物材料四、實(shí)驗(yàn)步驟1、粗酶液的提取稱取植物(小麥葉片)材料0.1g,加20mmol/L KH2PO4 5mL,于研缽中研磨成勻漿,以10000r/min離心10分鐘,收集上清液保存在冷處,所得殘?jiān)儆?0mmol/L KH2PO4 5mL溶液提取一次,合并兩次上清液。2、酶活性的測(cè)定取比色皿2只,于一只中加入反應(yīng)混合液3mL,KH2PO4 1mL,作為校零對(duì)照,另一只中加入反應(yīng)混合液3mL,上述酶液1mL(如酶活性過高可適當(dāng)稀釋),立即開啟秒表,于分光光度計(jì)470nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值,每隔30s讀數(shù)一次。以每分鐘表示酶活性大小,即以O(shè)D470/min.mg蛋白質(zhì)表示,蛋白質(zhì)含量測(cè)定按Folin法進(jìn)行。五、結(jié)果計(jì)算以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小,即以A470/min.g(鮮重)表
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