實驗4 淡水綠藻分離純化與種群增長影響因素分析

1、實驗四 淡水綠藻分離純化與種群增長影響因素分析一、實驗目的1.1了解常用的藻類培養(yǎng)基配方、適用性及其配置方法。1.2 掌握常用的藻類分離純化技術，熟悉藻類的培養(yǎng)設施。1.3 測試光照、溫度、鹽分、pH值等不同生態(tài)因子對藻類種群增長速率的影響。1.4 了解藻類的分子系統(tǒng)學等鑒定方法。二、實驗原理2.1純培養(yǎng)藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個體分離來，而獲純種培養(yǎng)。真正的“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細菌在內的一切生物的條件下進行的培養(yǎng)。這是進行科學研究不可缺少的技術，而在生產性培養(yǎng)中不排除細菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。用作預備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類是不同的，對一些難以

2、培養(yǎng)的藻類一般加入土壤抽出液較好。預備培養(yǎng)液營養(yǎng)成分濃度應小些，一般只有原配方的1/41/2。如水樣中藻類種類較多，就應使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來。可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/41/3培養(yǎng)液。然后把經篩絹過濾除去大型浮游生物的水樣接種進去，放在合適溫度下或室內靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時，容器可靜止不動；而培養(yǎng)浮游藻類時，應該每天搖動一次。有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機物，補充微量元素和輔助生長物質，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。2.1 培養(yǎng)基配方的選擇藻類培養(yǎng)基的

3、配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，表1列舉的是比較常用的幾種。 水生4號和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍藻可用朱氏10號或水生105號無氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍藻）；硅藻可用朱氏10號和水生硅1號培養(yǎng)基；另外還有海產綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。2.2 培養(yǎng)基的配制原則1）要有適量氮源（除固氮藍藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機氮等；2）應包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等；3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調節(jié)pH；4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）；5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍藻需鉬，硅藻需硅；6）要添加適量生長物質

4、如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。2.3 基礎培養(yǎng)基的配制方法表1各種培養(yǎng)基的用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內加入1.5瓊脂。2.4 土壤抽出液制作方法1）先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農田和庭院土）；2）再加入水使達5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時，連續(xù)二天（備注：由于氣泡上升，棉塞可能弄臟，因此最好先在水中煮一段時間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進行滅菌）。三、實驗儀器藥品移

5、液器 (200 ul， 1000 ul)，15 ml試管及配套試管塞，1.5ml EP管，9cm玻璃平皿，封口膜，保鮮袋，手套，口罩，超凈工作臺，顯微鏡，溫度計，電導率儀，pH計，光強測試儀，光照培養(yǎng)箱，表1所列全部試劑。四、實驗內容和步驟4.1 培養(yǎng)基的配制按表1配制水生4號培養(yǎng)液，調節(jié)pH值至7.5（左右）。固體培養(yǎng)基則在培養(yǎng)液內加入2.0%瓊脂。配好的培養(yǎng)基于高壓滅菌鍋內121滅菌20分鐘，待用。液體培養(yǎng)基可分裝入已滅菌的試管中；固體培養(yǎng)基待冷卻至50后，在超凈臺中倒入預先滅過菌的玻璃平板中。4.2 樣品的采集與富集培養(yǎng)采集湖泊或池塘中藻類的水樣，置于干凈的三角燒瓶中，放在合適溫度下或室

6、內靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時，容器可靜止不動；而培養(yǎng)浮游藻類時，應該每天搖動一次。 4.3 藻類的分離培養(yǎng)（1）稀釋分離法 把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過稀釋到適宜程度的方法，達到把原混雜生物單個分離培養(yǎng)的目的。在無菌條件下采用逐步稀釋的方法， 邊稀釋，邊在顯微鏡下鏡檢，直到鏡檢視野中每滴樣品只含有23 個細胞時，即停止稀釋，開始分接培養(yǎng)。具體過程如下：1）取已滅菌的1.5 mlEP管數(shù)個，在第一個試管中加藻液樣品1ml，其他EP管中加入一定體積的無菌富集培養(yǎng)液0.5ml；2）從第一管中取藻液0.5ml 加到第二管中，充分振蕩，使均勻稀釋，此

7、時藻液被稀釋了2倍；3）再用一支新的消毒刻度移液管，吸取第二管中的稀釋藻液0.5ml 加入第三支試管中， 如前振蕩，使均勻稀釋，此時藻液被稀釋了4 倍；4）以后依次同樣滴入第四管、第五管中，充分均勻稀釋，當?shù)沃恋谖骞軙r，此時藻液被稀釋了16 倍，鏡檢發(fā)現(xiàn)每滴稀釋樣品中只有2-3 個細胞， 可以用這樣的藻液進行培養(yǎng)；5）從稀釋16 倍的藻液中各取0.2 ml滴入1個含5 ml新鮮培養(yǎng)基的滅菌的試管中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，將試管放在有漫射陽光的地方，每日輕輕搖動幾次；6）1-2周后鏡檢，有的則既含綠藻，又有雜藻，將之舍棄；7）又過1-2周， 藻體不斷繁殖， 培養(yǎng)液顏色變綠，再次鏡檢了所有的試管，有的

8、試管中含有大量的單一綠藻A，有的含單一綠藻B，有的多種綠藻并存，有的含有綠藻與雜藻并存，再次舍混，留純。此時已達到了分離、純化的目的。（2）平板劃線分離法1) 采回后經富集培養(yǎng)的含藻水樣， 不用稀釋， 用一支無菌接種環(huán)蘸取一滴，在無菌平板培養(yǎng)基上輕輕劃線，劃3-4 條以后，把接種環(huán)在火焰上滅菌后，再通過第一次劃線區(qū)，以70 度左右的夾角，換一個方向第二次劃線3-4 條。2) 以同樣的方法做第三次、第四次劃線。然后蓋上培養(yǎng)皿，用封口膜封口后，置于恒溫、恒濕，具有適宜散射光照的培養(yǎng)架上培養(yǎng)。3) 兩周后可見到第一、二劃線區(qū)有連成一片或密集的藻落出現(xiàn)，而第三、四劃線區(qū)則零星地出現(xiàn)一些顏色不同的孤立的

9、藻落。4) 培養(yǎng)2-4周時， 用接種針從第三、第四劃線區(qū)挑取離相鄰藻落較遠的、綠色的藻落，在顯微鏡下檢查，找到純種藻落時，將該藻落用無菌解剖針挑入含有新鮮培養(yǎng)基的無菌試管中，在適宜條件下在恒溫光照搖床上繼續(xù)培養(yǎng)。5) 1-2周試管中的液體呈均勻綠色時，再一次鏡檢，確定沒有其他藻類、其他生物侵染時，即成功地得到單種培養(yǎng)的綠藻藻種。4.4 藻類鑒定和種群增長影響因素分析通過上述分離培養(yǎng)獲得的藻種，顯微觀察和畫示意圖，通過藻分類學參考書進行藻種鑒定。測試光照、溫度、鹽分、pH值等不同生態(tài)因子對藻類種群增長速率的影響，具體實驗過程由同學們自主設計試驗方案，待與老師討論后執(zhí)行。4.5 藻類的分子鑒定（有

10、深厚興趣的、實驗技術扎實的，學習態(tài)度好的同學可以找老師選做）分子鑒定實驗大致流程：將純養(yǎng)藻類10-50 ml離心后，藻細胞沉淀采用CTAB法提取基因組DNA，之后采用真核細胞通用引物對備注：4條基因核基因組rDNA的18S rRNA gene、內轉錄間隔區(qū)(ITS)、內轉錄間隔區(qū)2(ITS-2)和葉綠體rbcL基因中篩選出最為適用的引物對，進行PCR擴增和測序鑒定，具體實驗步驟參見環(huán)境生物技術實驗實驗一甲基營養(yǎng)菌的分離與鑒定。五、實驗結果分析與討論六、作業(yè)1. 除了本講義所列2種藻類分離純化方法外，再列舉2種以上其它的藻類分離純化方法。2. 你認為藻類的分離培養(yǎng)成功與否的關鍵是什么？3. 影響

11、藻類種群生長的生態(tài)因子有哪些？結合試驗結果談談藻類種群增長的規(guī)律？4. 通過期刊網查找藻類的鑒定方法？成功案例中國藻類學會第八次會員代表大會暨第十六次學術討論會論文摘要集2011年加入收藏 獲取最新產油微藻O.multisporus的分子生物學鑒定楊勛 劉平懷 時杰 郝宗娣 張森 【摘要】：從海南淡水水體分離得到一株富油微藻,通過形態(tài)觀察及分子生物學鑒定其為Ourococcus multisporus。微藻DNA提取采用生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒,所提DNA于-4冰箱保存?zhèn)溆?。DNA擴增采用真核生物18S rDNA擴增通用引物18SF(5-CCTGGTTGATC CTGC CAG-3)和18SR(5-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3)。PCR反應條件為98預變性5min,然后9535 S,5535 S,7240 S,35個循環(huán)后于72延伸8min。PCR產物經電泳后采用生工SK1131膠回收試劑盒回收,將目標片段連接到PUCm-T載體上克隆,選擇陽性載體測序。獲得測序結果后,用BLAST軟件對基因序列的同源性進行分析,從數(shù)據(jù)庫下載相似的18S rDNA部分序列,