人血清中小分子蛋白質(zhì)分離電泳方法改進

1、    人血清中小分子蛋白質(zhì)分離電泳方法改進            作者：時間：2007-11-22 11:40:00                            

2、60;        作者：韋霄，何敏，農(nóng)炳金，蔣智華，覃健，張志勇 【關(guān)鍵詞】  ,聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)；分離摘要： 目的  建立一種靈敏易行分離分子量10 000 Da低豐度蛋白質(zhì)的電泳方法。方法  用Hitrap Blue層析柱去除血清中白蛋白，用U9對血清樣品進行變性處理，采用改進后的方法(01%甲醇，05%三氯乙酸，01%考馬斯亮藍G250)進行染色。結(jié)果  經(jīng)去除血清中的白蛋白、對樣品進行變性處理及改進染色方法后，分辨率和靈敏度明顯提高，可有效分離10 000 Da以

3、下的小分子蛋白質(zhì)。結(jié)論  改進后的電泳方法，不僅簡便靈敏，而且還有利于蛋白質(zhì)的洗脫回收。關(guān)鍵詞： 聚丙烯酰胺凝膠電泳；蛋白質(zhì)；分離Separation of micro molecular protein in human serum with improved Tricine-SDS-PAGE system  Gangxi Center For Disease Control and Prevention(Nanning 530021,China)Abstract： Objective  To separate less abundant proteins le

4、ss than 10 000 Da with an effective Tricine-SDS-PAGE system.Methods  The human serum albumin was removed by Hitrap Blue column,and serum was dealed with U9.Then gel was stained by the improved method(01% carbinol,05% TCA,01%Coomassie briliant blue G250).Results  The discovery and detection

5、 of less abundant proteins less that 10 000 Da were improved obviously by removal of human serum albumin,serum treated with U9 and improvement of staining.Conclusion  The improved Tricine-SDS-PAGE system is not only effective to resolve these less abundant proteins less than 10 000 Da,but also

6、favourable to recover these proteins from gel.Key words： SDS-PAGE;protein;separation    患者血清中某些小分子蛋白標志物可以用于疾病監(jiān)測和快速診斷，但分離分子量10000Da的小分子蛋白質(zhì)面臨很多問題。三(羥甲基)甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝膠電泳(TricineSDSPAGE)是目前一種有效分離小分子蛋白、多肽的電泳方法，可以用于分離小至1kDa的小分子肽1。但其分離效果與樣品處理、樣品中目的蛋白含量以及染色方法等密切相關(guān)。文獻報道，使用TricineSDSPAGE分離小分子蛋白的樣

7、品多為蛋白質(zhì)標準品1-3。作者在分離小分子肽的實驗中發(fā)現(xiàn)，根據(jù)文獻報道的方法，對于分離蛋白標準品或高豐度蛋白效果尚可，但直接用于分離人血清中低豐度的小分子蛋白效果并不理想。因此，作者在樣品的處理、染色等方面進行改進，建立了一種效果理想、簡便靈敏的分離人血清中小分子蛋白質(zhì)的方法。結(jié)果報告如下。1  材料與方法11  材料111  試劑與儀器  磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、尿素、丙烯酰銨、N，N-甲叉雙丙烯酰銨、過硫酸銨、鹽酸、氫氧化鈉、甘油、溴酚藍、三氯乙酸(TCA)、甲醇、戊二醛、醋酸、考馬斯亮藍G250、低分子量蛋白質(zhì)標準品、三羥甲基氨基甲烷(Tr

8、is)、三羥甲基甲基甘氨酸(Tricine)、二硫蘇糖醇(DTT)、3-(3-膽酰胺丙基)-二乙胺-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)(上海生工生物工程有限責任公司)；AKTA Purifier-900層析系統(tǒng)、Hitrap Blue層析柱(美國Amersham Biosciences公司)；Power Pac HCTW電泳儀、Mini Protean 3well垂直電泳槽(美國Bio-Rad公司)；搖床(江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。112  樣品  樣品取自廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)病理診斷的肝細胞癌患者血清。12

9、0; 方法121  溶液配制  (1)層析緩沖液配制：結(jié)合緩沖液為390ml的20mmol NaH2PO4和610ml的20mmol Na2HPO4溶液混合成1000ml的磷酸鹽緩沖液，用HCl調(diào)pH值至70。用配制好的結(jié)合緩沖液配500ml的2mol NaCl磷酸鹽洗脫緩沖液。(2)凝膠貯存液配制：A貯液為495%丙烯酰銨總濃度，3%交聯(lián)度的丙烯酰銨貯存液：稱取48g丙烯酰銨和15g N，N-甲叉雙丙烯酰銨，溶于100ml雙蒸水，溶液混勻后經(jīng)濾紙過濾。B貯液為495%丙烯酰銨總濃度，6%交聯(lián)度的丙烯酰銨貯存液：稱取465g丙烯酰銨和3g N，N-甲叉雙丙烯酰銨溶于100m

10、l雙蒸水，溶液混勻后經(jīng)濾紙過濾。膠緩沖液為3mol Tris，03g/L SDS用HCl調(diào)pH值至845。(3)蛋白質(zhì)電泳溶液配制：陽極緩沖液為02 mol Tris,用HCl調(diào)pH值至89，陰極緩沖液為01mol Tris，01mol Tricine，03g/L SDS用HCl調(diào)pH值至825。(4)樣品緩沖液配制：3mol Tris(pH 845)，24 ml甘油，08g SDS,03mol DTT，少許溴酚藍，定容至10ml。122  層析柱去除白蛋白  凍融血清，4，12000r/min，離心5min，取上清液1ml，用9ml結(jié)合緩沖液按19比例稀釋上樣于Hitra

11、p Blue層析注，在AKTA Purifier900層析系統(tǒng)上進行層析分離，用磷酸鹽洗脫緩沖液以流速2ml/min進行洗脫。在層析過程中，AKTA Purifier900層析系統(tǒng)自動收集未與層析柱結(jié)合部分的溶液和洗脫液(1ml/管)，并繪出280nm波長處的吸光度(A280nm)曲線。123  膠的制備  按文獻2分別配制分離膠、間隙膠和濃縮膠，依次灌膠。124  樣品處理  將樣品1(未與層析柱結(jié)合部分的溶液)和樣品2(洗脫液)，分別倒入3000Da的超濾離心管，4，12000r/min，離心濃縮2h，濃縮體積至1ml。分別加入到含2ml U9緩沖液

12、(9mol Urea,2%CHAPS,1%DTT)的離心管，400600r/min冰浴振蕩30min。取樣品1、2分別與樣品緩沖液等體積混勻，60水浴加熱5min。125  電泳條件  內(nèi)槽裝陰極緩沖液，外槽用陽極緩沖液恒壓電泳，先40 V約15 h，當樣品進入分離膠時，電壓升至60V約15h。126  染色和脫色  電泳結(jié)束時，用雙蒸水把膠面洗凈。分別采用方法1：置于新鮮配制的5%戊二醛溶液中固定，5060r/min，振蕩1h。然后用雙蒸水洗凈膠面，用含0025%考馬斯亮藍G250的10%醋酸溶液染色，5060r/min，振蕩1h，最后轉(zhuǎn)至10%醋酸溶

13、液脫色，直到背景清晰。方法2：置于染色液(01%甲醇，05%TCA，01%考馬斯亮藍G250)中，5060r/min，振蕩染色1h。然后用雙蒸水洗凈膠面，轉(zhuǎn)至雙蒸水脫色，1h。更換雙蒸水2次，直到背景清晰。2  結(jié)果21  層析柱去除血清白蛋白前后的比較(圖1，圖2)  血清經(jīng)Hitrap Blue層析柱分離后，得到2個吸收峰，分別命名為組分、組分。組分為未與層析柱結(jié)合的蛋白質(zhì)，組分為白蛋白洗脫液。組分、與血清原樣的電泳結(jié)果比較顯示，血清原樣白蛋白污染嚴重，組分經(jīng)去除白蛋白后，白蛋白污染顯著減少，電泳可分離出10000Da以下的小分子蛋白質(zhì)。圖1  經(jīng)Hitrap Blue層析柱分離的各組分（略）A：低分子量蛋白質(zhì)標準品；B：血清原樣；C：組分；D：組分圖2  不同組分電泳結(jié)果比較（略）22  樣品用U9處理前后比較(圖3)  組分用U9處理前后的凝膠圖顯示，未用U9處理的樣品，分離10000Da以下的小分子蛋白效果不佳；用U9處理后的樣品，10000Da以下的小分子蛋白清晰可見。23  不同染色方法比較(圖4)  相同樣本凝膠分別用方法1和方法2進行考馬斯亮藍染色。結(jié)果顯示，用方法1染色，凝膠背景顏色深，分離10000Da以下的小分子蛋白效果不佳；用方法2染色，凝膠背景