生物技術(shù)制藥實(shí)驗(yàn)四 (2)

1、試驗(yàn)四：土壤中放線(xiàn)菌的分別試驗(yàn)學(xué)時(shí)：5學(xué)時(shí)試驗(yàn)類(lèi)型：驗(yàn)證性試驗(yàn)、綜合性試驗(yàn)試驗(yàn)要求：必修一、試驗(yàn)?zāi)康膎 從土壤中分別、純化放線(xiàn)菌；初步把握微生物的分別純化方法和操作技術(shù)。n 了解不同生境條件中土壤放線(xiàn)菌的種類(lèi)與數(shù)量。二、試驗(yàn)內(nèi)容篩選放線(xiàn)菌永久是新抗生素爭(zhēng)辯的課題之一。迄今為止，已發(fā)覺(jué)的抗生素約有80%來(lái)自于放線(xiàn)菌。土壤中放線(xiàn)菌最豐富，品種齊全。通常狀況下，放線(xiàn)菌在比較干燥、偏堿性、含有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中數(shù)量居多。隨著地理分布、植被及土壤性質(zhì)的不同，放線(xiàn)菌的種類(lèi)、數(shù)量和拮抗性也各不相同。從堆肥或過(guò)熱的材料中如干草或蔗渣中可分別到大量的嗜熱放線(xiàn)菌，從淡水和海洋環(huán)境中可分別到嗜堿性的和嗜酸性的菌種。土

2、壤中含有的放線(xiàn)菌主要是鏈霉菌，人們通常將除鏈霉菌以外的其它放線(xiàn)菌統(tǒng)稱(chēng)為稀有放線(xiàn)菌，如小單孢菌、游動(dòng)放線(xiàn)菌、諾卡氏菌等，它們是生物活性物質(zhì)重要的產(chǎn)生菌。但往往由于樣品中稀有放線(xiàn)菌的數(shù)量太少，常規(guī)的分別方法很難得到。對(duì)樣品進(jìn)行風(fēng)干、干熱處理、培育基添加重鉻酸鉀等方法可以削減細(xì)菌和真菌的數(shù)量，以提高放線(xiàn)菌的獲得率。用干熱和苯酚處理可削減鏈霉菌數(shù)量和比例的方法，可以分別得到更多種類(lèi)的放線(xiàn)菌。土壤中分別放線(xiàn)菌的方法很多，其中包括稀釋法、彈土法、混土法和噴土法等，本試驗(yàn)主要接受稀釋法來(lái)獲得放線(xiàn)菌。注：從土壤中分出的放線(xiàn)菌要進(jìn)一步鑒別是否為抗生菌。首先應(yīng)依據(jù)篩選目的確定試驗(yàn)?zāi)Ｐ停缓罄门嘤桨暹M(jìn)行拮抗性

3、測(cè)定。常用的方法有瓊脂塊法和濾紙片法。其主要依據(jù)是集中原理，即觀(guān)看在抗生菌四周是否會(huì)消滅明顯的抑菌圈。抑菌圈的大小和透亮度則表明白該菌株抗菌活性的強(qiáng)弱。三、試驗(yàn)原理、方法和手段原理一：稀釋涂布平板法；如圖1。原理二：對(duì)樣品進(jìn)行風(fēng)干、干熱處理以削減細(xì)菌和真菌的數(shù)量；原理三：向培育基添加適量的重鉻酸鉀能抑制其他細(xì)菌、真菌的生長(zhǎng)，但不影響放線(xiàn)菌的生長(zhǎng)。四、試驗(yàn)組織運(yùn)行要求依據(jù)本試驗(yàn)的特點(diǎn)、要求和具體條件，接受“接受集中授課形式，分組試驗(yàn)進(jìn)行”的組織運(yùn)行模式。圖1 稀釋涂平板法示意圖五、試驗(yàn)條件試劑與儀器 試劑：可溶性淀粉、KNO3、K2HPO4·3H2O、NaCl、FeSO4·7

4、H2O、MgSO4·7H2O、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉、pH試紙、重鉻酸鉀儀器：微波爐、電磁爐、干燥箱、玻璃涂鏟、50或100mL量筒（滅菌）、90mm培育皿（滅菌）、1或2mL移液管（滅菌）、標(biāo)簽紙、小玻璃珠（滅菌）、洗耳球。培育基：高氏1號(hào)合成培育基：可溶性淀粉20 g，KNO3 1.0 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g， MgSO4·7H2O 0.5 g，pH:7.27.4，瓊脂20 g，水1000 mL，分裝，高壓濕熱滅菌。 培育基制備過(guò)程（授課老師預(yù)備）：稱(chēng)取肯定量可溶性淀粉，放入裝有

5、少量水的小燒杯中，用玻棒將淀粉調(diào)成糊狀，再加入少于所需水量的沸水中，連續(xù)加熱，使可溶性淀粉完全溶化。再稱(chēng)取其他各成分依次溶解。對(duì)微量成分FeSO4·7H2O可先配成高濃度的貯備液后再加入，方法是先在10ml水中加入0.1g的FeSO4·7H2O配成0.01g/ml母液，再在1000ml培育基中加入1ml的001g/ml的貯備液即可。待全部藥品完全溶解后，補(bǔ)充水分到所需的總體積，調(diào)整pH、分裝、包扎、濕熱滅菌。土樣：從校內(nèi)各處采樣。要求同學(xué)到不同生境、不同深度土壤中取樣，如：塘泥、森林、苗圃、路邊菜園土或林地土，適量、自然風(fēng)干，待用。六、試驗(yàn)步驟土樣基本處理：每處理隨機(jī)取不同

6、土壤約100 g，自然條件下風(fēng)干，顏色由深變淺后碾碎，過(guò)孔徑為840 m（20目）的土壤篩（或人工挑取較大的石?；蛲翂K）。用無(wú)菌的報(bào)紙將土樣包好（單層）（也可用牛皮信封），放到電熱鼓風(fēng)干燥箱中，60干熱處理1h。（老師在課堂講授前先指導(dǎo)同學(xué)完成該步驟的試驗(yàn)）倒平板：將裝有滅好菌的高氏一號(hào)培育基的三角瓶直接置于微波爐中加熱溶解(視狀況定加熱時(shí)間，老師留意提示同學(xué)把握好加熱的時(shí)間)、冷卻后倒平板，每皿約20 mL。待充分冷卻后用于涂布。稱(chēng)取待測(cè)樣品10.0 g（盛放于滅菌紙中），放入裝有90 mL無(wú)菌水的250 mL三角瓶中，充分振蕩10 min，即配成10-1稀釋度的土懸液；用移液管量取1mL

7、稀釋度為10-1的土壤懸浮液于裝有9mL無(wú)菌水的試管中，充分振蕩，即配成10-2稀釋度的土壤懸浮液，按此法依次配成10-3，10-4稀釋度的懸浮液。用平板表面成菌落法測(cè)定土壤中微生物數(shù)量。將配好不同稀釋度（10-2，10-3，10-4）的菌懸液，用無(wú)菌移液管吸取0.2 mL土壤懸液接種在不同的稀釋度編號(hào)的平板上，每個(gè)處理重復(fù)2次，用無(wú)菌刮鏟將菌液在平板上均勻涂開(kāi)，每個(gè)稀釋度用一個(gè)刮鏟，假如從低濃度到高濃度涂布，可不用換刮鏟。將涂好的平板置于操作臺(tái)面上2030 min，使菌液充分滲透于培育內(nèi)，然后將平板倒放，置于28 條件下恒溫培育至長(zhǎng)出菌落開(kāi)頭計(jì)數(shù)，觀(guān)看。試驗(yàn)分為兩大組處理：17組同學(xué)無(wú)需向高氏一號(hào)培育基中加入0.5 重鉻酸鉀溶液，直接置于微波爐中加熱溶解、冷卻后倒平板；822組同學(xué)需向已加熱溶解并冷卻至60高氏一號(hào)培育基中加入3 mL 0.5%重鉻酸鉀溶液，充分搖勻后倒平板。七、思考題與作業(yè)1. 不同生境土壤放線(xiàn)菌的多樣性？（由授課老師指導(dǎo)全班同學(xué)共同完成這一項(xiàng)作業(yè)）2. 土壤中（濕重）放線(xiàn)菌的數(shù)量與培育特征描述。（授課老師供應(yīng)數(shù)碼相機(jī)拍照完成）3. 基于本次試驗(yàn)的基礎(chǔ)，請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)一個(gè)從土壤中分別稀有放線(xiàn)菌的試驗(yàn)。（簡(jiǎn)要說(shuō)明即可）。八、試驗(yàn)報(bào)告按規(guī)范格式寫(xiě)出試驗(yàn)報(bào)告（試驗(yàn)挨次、名稱(chēng)、姓名、學(xué)號(hào)、試驗(yàn)?zāi)康?、原理、步驟、試驗(yàn)結(jié)果與記錄、思考題、留意事項(xiàng)