成像流式細(xì)胞儀原理及應(yīng)用

1、二代流式技術(shù)產(chǎn)品-成像流式細(xì)胞分析邱又彬Merck&Millipore旗下品牌Amnis于近期推出了新一代高速細(xì)胞成像系統(tǒng)ImageStreamX Mark II。這是第三代ImageStream成像流式細(xì)胞儀，具有無與倫比的細(xì)胞分析能力。顯微鏡可提供詳細(xì)的細(xì)胞圖像和形態(tài)信息，是研究細(xì)胞功能的重要工具。然而，顯微圖像的解釋卻是主觀、定性且費(fèi)力的。流式細(xì)胞儀擅長定量的表型分析，可產(chǎn)生統(tǒng)計(jì)學(xué)上可靠的結(jié)果，不過，流式細(xì)胞儀卻缺乏成像能力，因此無法了解亞細(xì)胞定位。ImageStream系列開創(chuàng)性地將流式細(xì)胞檢測(cè)與熒光顯微成像結(jié)合于一體，既能提供細(xì)胞群的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，又可以獲得單個(gè)細(xì)胞的圖像，從而提

2、供了細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞信號(hào)分布的完整信息。ImageStreamX Mark II能實(shí)時(shí)捕獲每個(gè)流動(dòng)細(xì)胞最多12幅高分辨率圖像，檢測(cè)速率可達(dá)5000細(xì)胞/秒，并具有更強(qiáng)熒光靈敏度。ImageStreamX Mark II的這些功能可以對(duì)細(xì)胞形態(tài)、熒光探針的強(qiáng)度和定位進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而為科學(xué)家提供廣泛的圖像分析應(yīng)用，包括細(xì)胞間相互作用、吞噬、凋亡和自噬、核易位、形態(tài)變化等。ImageStreamX Mark II的特征如下：速度更快：Mark II對(duì)進(jìn)樣速度進(jìn)行了提升，每秒可以分析多達(dá)5000個(gè)細(xì)胞，簡(jiǎn)單易用的補(bǔ)償向?qū)Э梢灾笇?dǎo)您輕松完成多色補(bǔ)償運(yùn)算。操作更簡(jiǎn)單：全新而直觀的用戶界面提供了每

3、一個(gè)細(xì)胞的圖像及實(shí)時(shí)繪圖相關(guān)的圖形化控件。樣品適應(yīng)性更強(qiáng)：Mark II可選配7個(gè)激光；樣品容量20-200 l，增加了實(shí)驗(yàn)的靈活性，適用于多用戶實(shí)驗(yàn)室。樣品利用率更高：Mark II將樣品利用率提高到了95%，更適用于稀有的細(xì)胞樣品，而且未使用的樣品也可回收用于進(jìn)一步分析。從2005年開始，Amnis量化成像流式分析儀被廣泛應(yīng)用于各個(gè)研究領(lǐng)域。其中超過300篇的文章發(fā)表在高水平的同行評(píng)議雜志（peer-reviewed journal）上。這些研究領(lǐng)域包括生物化學(xué)、藥物研發(fā)、血液、免疫、微生物、海洋、腫瘤、寄生蟲、干細(xì)胞、毒理、病毒等等。并且由于Amnis與眾不同的實(shí)驗(yàn)理念和卓越性能，使得這

4、個(gè)名單不斷變長。1. 生物化學(xué)：經(jīng)典的生物化學(xué)技術(shù)主要用于分子定位和共定位檢測(cè)，這非常適合使用Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)，比如轉(zhuǎn)錄因子從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位、分子在亞細(xì)胞器間的運(yùn)輸、蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的共定位。它可以獲取復(fù)雜樣品每個(gè)細(xì)胞中探針定位和共定位的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果，這對(duì)于傳統(tǒng)生物化學(xué)研究是極大的補(bǔ)充和拓展。示例1：T細(xì)胞-抗原遞呈細(xì)胞中NF-B的轉(zhuǎn)運(yùn)：NF-B在與抗原遞呈細(xì)胞（APC）和特異性多肽連接的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞中從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位。在此使用Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號(hào)的相似性，即Similarity值越高代表NF-B（綠色）和7-AAD染核（紅色）信號(hào)相

5、似度越高。示例2：抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位：熒光特異性標(biāo)記的抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物（ADC）通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位。此處endosome/lysosomecolocalization的衡量是通Bright Detail Similarity參數(shù)實(shí)現(xiàn)的，它代表的是兩幅圖像中熒光亮點(diǎn)的位置。示例3：ImageStream系統(tǒng)中利用FRET（熒光能量共振轉(zhuǎn)移）檢測(cè)蛋白質(zhì)間的相互作用： FRET（熒光能量共振轉(zhuǎn)移）：在熒光顯微鏡下可以看到，熒光團(tuán)可以在吸收一個(gè)波長的光之后發(fā)射出波長較長的光；當(dāng)?shù)诙€(gè)熒光團(tuán)離第一個(gè)熒光團(tuán)足夠近的時(shí)候，它就可以從第一熒光團(tuán)獲取

6、能量，發(fā)射出波長更長的光。FRET對(duì)于熒光團(tuán)之間的距離很敏感，如果發(fā)生了FRET，說明熒光團(tuán)之間的距離大約是在10 nm。當(dāng)用兩個(gè)熒光團(tuán)分別標(biāo)記蛋白時(shí)，可以通過供體和受體熒光團(tuán)間的FRET來推斷蛋白質(zhì)間的距離。ImageStream可以定量分析稀有細(xì)胞亞群中的FRET，來衡量細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用和細(xì)胞間連接。區(qū)別胞內(nèi)發(fā)生和未發(fā)生FRET蛋白的位置可以改進(jìn)我們對(duì)于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的理解。下圖所示，受體1和受體2分別用PE（供體）和AF647（受體）標(biāo)記。收集細(xì)胞圖片用488 nm激光激發(fā)。受刺激的樣品中可以檢測(cè)到AF647熒光團(tuán)，說明發(fā)生了FRET現(xiàn)象。2. 藥物研發(fā)：藥物研發(fā)的目標(biāo)是找到高質(zhì)量的、可

7、以改善治療效果的候選藥物。利用相關(guān)信息分析可以很快的減少候選藥物的數(shù)量，選出那些既不影響效果又不會(huì)引起不可預(yù)見的致命后果的候選藥物，這會(huì)節(jié)省藥品公司為了淘汰某些候選藥物進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)而花費(fèi)的時(shí)間和金錢。Amnis的量化成像流式分析系統(tǒng)的一些應(yīng)用非常適合鑒定藥物的性質(zhì)，包括細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間相互作用、化學(xué)因子誘導(dǎo)的細(xì)胞形變、細(xì)胞死亡、共定位和吞噬。而且，這些應(yīng)用非常適于全血白細(xì)胞這樣的異源、原代細(xì)胞。示例 1：抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位：熒光特異性標(biāo)記的抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物（ADC）通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位。此處endosome/lysosomecol

8、ocalization的衡量是通Bright Detail Similarity參數(shù)實(shí)現(xiàn)的，它代表的是兩幅圖像中熒光亮點(diǎn)的位置。示例 2：條碼：篩選候選藥物需要對(duì)大量樣品進(jìn)行快速分析。ImageStream可以將時(shí)程、劑量因素結(jié)合起來放在1管中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這大大提高了系統(tǒng)的通量。這個(gè)過程是這樣實(shí)現(xiàn)的，每個(gè)樣品會(huì)基于特定的時(shí)間點(diǎn)和處理方式被染上特定強(qiáng)度的熒光染料，就像給它們打上了條形碼。系統(tǒng)會(huì)根據(jù)熒光顏色及其強(qiáng)度自動(dòng)確定細(xì)胞群體，反推出標(biāo)記樣品。下圖展示的例子是，在不同的時(shí)間點(diǎn)添加不同劑量的TNF-對(duì)胞內(nèi)NF-B從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核發(fā)生轉(zhuǎn)位程度的測(cè)量。在ImageStream系統(tǒng)中，可以用AlexaF

9、luor 405、488和 660和四種不同的濃度做排列組合來標(biāo)記64個(gè)樣品在一個(gè)管中完成測(cè)量。在10到15分鐘內(nèi)接收600000張圖片，為了進(jìn)一步定量分析圖片，可以根據(jù)樣品顏色和強(qiáng)度的排列組合進(jìn)行反推。電子表格中是Similarity打分的平均值，這種結(jié)果可以以heatmap的形式呈現(xiàn)。注：AlexaFluor 405、488和 660染THP-1細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生四種熒光密度形式negative、dim、med、bright，三種染料就會(huì)有64種染料-熒光密度組合。其作用原理是，本身沒有熒光，其ester group使其進(jìn)入細(xì)胞，如果是活細(xì)胞的話，酯酶（esterase）使其ester group

10、裂解，使AF成為熒光形式succinimidyl ester group形式并與細(xì)胞內(nèi)蛋白胺基共價(jià)連接；死細(xì)胞不會(huì)發(fā)光。細(xì)胞分裂時(shí)平均分配到兩個(gè)子代細(xì)胞內(nèi)。與蛋白連接的共價(jià)鍵非常牢固，即使經(jīng)過固定、打孔仍可以保持在細(xì)胞內(nèi)。3. 血液學(xué)：血液學(xué)家通常會(huì)使用顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)兩種方式來對(duì)血細(xì)胞、造血系統(tǒng)和血系統(tǒng)寄生蟲進(jìn)行研究和分類。Amnis獨(dú)有的對(duì)大量懸浮細(xì)胞進(jìn)行圖像定量分析能力使得其特別適合血液學(xué)領(lǐng)域。這方面應(yīng)用包括，將免疫表型和形態(tài)學(xué)結(jié)合起來對(duì)紅細(xì)胞生成不同階段進(jìn)行劃分，鑒定鐮刀血細(xì)胞或者寄生蟲感染的血紅細(xì)胞，定量分析吞噬、共定位、化學(xué)因子誘導(dǎo)的形變、血細(xì)胞特異性亞群中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。示例：

11、紅系細(xì)胞分化：造血干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化過程中，在向紅細(xì)胞分化時(shí)中會(huì)發(fā)生收縮、進(jìn)而脫核的現(xiàn)象。同時(shí)，血型糖蛋白A的表達(dá)逐漸增加，而CD71逐漸降低。這個(gè)實(shí)驗(yàn)向我們展示的是ImageStream在將強(qiáng)度、形態(tài)和定位結(jié)合起來將細(xì)胞進(jìn)行分類的獨(dú)特能力。下圖所示的是細(xì)胞核脫出的過程，利用Delta centroid XY 來衡量細(xì)胞核DRAQ5染色和血型糖蛋白A之間的位置關(guān)系。Delta centroid XY是指兩個(gè)圖像選區(qū)中心點(diǎn)間的距離。4. 免疫學(xué)：先天和獲得性免疫系統(tǒng)中的細(xì)胞保證人體免受病原體的攻擊。免疫系統(tǒng)中不同類型的細(xì)胞的區(qū)別不僅是細(xì)胞表面標(biāo)志物的差別，還有對(duì)于不同病原體或是刺激的反應(yīng)。將定

12、量圖像分析工具和流式細(xì)胞術(shù)的大樣本量結(jié)合起來，ImageStream可以獨(dú)特的將多種應(yīng)用使用在免疫學(xué)領(lǐng)域，包括轉(zhuǎn)錄因子的細(xì)胞核轉(zhuǎn)位、T細(xì)胞和抗原遞呈細(xì)胞的相互作用和免疫突觸上的蛋白質(zhì)聚集、化學(xué)因子誘導(dǎo)的形變和吞噬。示例 1：NF-B在與抗原遞呈細(xì)胞結(jié)合的T細(xì)胞中的轉(zhuǎn)位：NF-B在與抗原遞呈細(xì)胞（APC）和特異性多肽連接的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞中從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位。在此使用Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號(hào)的相似性，即Similarity值越高代表NF-B（綠色）和7-AAD染核（紅色）信號(hào)相似度越高。示例 2：鼠巨噬細(xì)胞的吞噬作用：免疫表型鑒定鼠巨噬細(xì)胞系RAW（橙色）對(duì)酵母聚糖的內(nèi)

13、化作用。37度條件下，分別在加入酵母聚糖15、30、60分鐘時(shí)檢測(cè)發(fā)生內(nèi)化作用細(xì)胞的百分比。內(nèi)化作用的衡量參數(shù)是Internalization，是指細(xì)胞內(nèi)某物質(zhì)熒光與代表整個(gè)細(xì)胞熒光的比值。示例 3：HIV引起的特異性的NFAT轉(zhuǎn)位：來源于HIV陽性病人的外周血中HIV激活T細(xì)胞核中NFAT的入核現(xiàn)象。在HIV四聚體陽性細(xì)胞（橙色）中，HIV鞘蛋白gag特異性刺激NFAT（綠色）轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核（紅色）中。Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號(hào)的相似性，分值與DRAQ5核染色和NFAT信號(hào)的重疊性相關(guān)。Similarity參數(shù)打分越高，樣品中發(fā)生轉(zhuǎn)位的細(xì)胞越多。5. 微生物學(xué)：微生物因其致

14、病性對(duì)于人類健康和疾病預(yù)防十分重要。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)由于其具有圖像參數(shù)，所以可以基于形態(tài)學(xué)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分類，并且可以檢測(cè)它們的復(fù)制過程。致病菌有一套跨越機(jī)體免疫系統(tǒng)的方法，其中包括對(duì)吞噬細(xì)胞內(nèi)化作用的抑制。微生物與宿主細(xì)胞的相互作用是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，可以用Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)研究這個(gè)過程，包括自身免疫系統(tǒng)對(duì)病原體的內(nèi)吞和清除、胞內(nèi)細(xì)菌的維持和擴(kuò)增以及細(xì)菌感染對(duì)于宿主細(xì)胞信號(hào)通路和存活的影響。示例：有害細(xì)菌鑒定和成絲化分析：從培養(yǎng)或是殘余食物當(dāng)中獲得的細(xì)菌可以定量的分析其大小、形態(tài)和特異性FISH探針的熒光強(qiáng)度。成絲化無論是復(fù)制缺陷造成的，還是對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的反應(yīng)，都

15、可以測(cè)量。衡量細(xì)菌成絲程度使用的是尺寸參數(shù)Length，測(cè)量的是選區(qū)（細(xì)胞）長度。第二幅圖是用特異性FISH探針檢測(cè)變質(zhì)食物中的沙門氏菌。6. 海洋學(xué)：海水的成分和物種對(duì)于研究海洋環(huán)境中復(fù)雜的相互作用是非常關(guān)鍵的。浮游生物種類和數(shù)量是漁業(yè)生產(chǎn)、水質(zhì)監(jiān)測(cè)和保持物種多樣性的重要指標(biāo)。因?yàn)檫@些海洋生物是漂浮的，具有復(fù)雜的形態(tài)，Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)對(duì)于鑒定硅藻的數(shù)量、測(cè)量海藻細(xì)胞分裂和研究以浮游生物為食生物的分布十分理想。示例：分析碼頭纜繩上微生物的形態(tài)和體積：定量分析培養(yǎng)基或者海水中特殊的硅藻和其他浮游生物的體積、形態(tài)、熒光強(qiáng)度、結(jié)構(gòu)以及熒光探針或者葉綠體的定位和共定位。形態(tài)學(xué)參數(shù)Aspe

16、ct Ratio測(cè)量圖像選區(qū)（細(xì)胞）中短軸與長軸的長度比值，尺寸參數(shù)Area測(cè)量圖像選區(qū)（細(xì)胞）面積。7. 腫瘤學(xué)：腫瘤學(xué)的研究主要涉及癌癥的發(fā)展過程和治療方法。腫瘤學(xué)家不僅使用顯微鏡對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行鑒定和分類，還要鑒定化學(xué)藥物引起的凋亡細(xì)胞中細(xì)胞核的片段化，或是追蹤治療性單克隆抗體的結(jié)合和內(nèi)化過程。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)可以將免疫表型和量化的形態(tài)學(xué)參數(shù)結(jié)合起來，將其應(yīng)用于潛在轉(zhuǎn)移細(xì)胞總的稀有亞細(xì)胞群的鑒定，比如循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）。示例 1：抗體藥物耦聯(lián)復(fù)合物與內(nèi)涵體或溶酶體的共定位：熒光特異性標(biāo)記的抗體-藥物耦聯(lián)復(fù)合物（ADC）通過細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞后與內(nèi)涵體和溶酶體的共定位。此處

17、endosome/lysosomecolocalization的衡量是通Bright Detail Similarity參數(shù)實(shí)現(xiàn)的，它代表的是兩幅圖像中熒光亮點(diǎn)的位置。示例2：凋亡系數(shù)： DNA固縮和片段化是細(xì)胞凋亡一個(gè)顯著的標(biāo)志。通過測(cè)量細(xì)胞核圖像中最亮部分的面積和強(qiáng)度，凋亡細(xì)胞有亮點(diǎn)的細(xì)胞核圖像可以和正常、健康細(xì)胞核染色圖像區(qū)別開。這使得自動(dòng)鑒定細(xì)胞凋亡成為可能。結(jié)構(gòu)分析參數(shù)Bright Detail Intensity測(cè)量的是所選區(qū)域內(nèi)某像素范圍內(nèi)的顆粒數(shù)。8. 寄生蟲學(xué)：寄生蟲是人類健康的大敵，它可以引起疾病甚至死亡，比如瘧疾、非洲嗜睡病、黑熱病和萊姆病。人類對(duì)于寄生蟲如何感染機(jī)體和宿

18、主免疫系統(tǒng)以及如何清除外來入侵的理解對(duì)于開發(fā)有效治療方法至關(guān)重要。Amnis量化成像流式分析不僅可以檢測(cè)被感染細(xì)胞，還可以確定細(xì)胞內(nèi)寄生的寄生蟲的數(shù)量以及它們對(duì)亞細(xì)胞信號(hào)通路的影響。示例：椎體蟲：椎體蟲可以引起非洲嗜睡病。下圖所示是定量研究GFP標(biāo)記分子入核現(xiàn)象的兩個(gè)例子。直方圖顯示的是每個(gè)細(xì)胞的GFP圖像和DRAQ5染核圖像的一致性，用similarity這個(gè)參數(shù)來打分表示。Similarity參數(shù)是指兩幅圖像間像素信號(hào)的相似性。Similarity打分高說明GFP圖像和DRAQ5染核圖像高度相似（GFP轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)）。低的Similarity打分說明沒有發(fā)生核轉(zhuǎn)位。9. 干細(xì)胞：在體內(nèi)，

19、干細(xì)胞具有分化成各種細(xì)胞的能力。闡明這個(gè)過程可以促使我們更好的理解動(dòng)物發(fā)育的過程和制定出更好的替代受損組織的治療方案。由于干細(xì)胞在向終末分化細(xì)胞分化過程中通常會(huì)涉及到明顯的細(xì)胞形變，所以Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)十分適于這方面的研究。測(cè)量維持干細(xì)胞多潛能性蛋白的細(xì)胞定位或是衡量干細(xì)胞分化過程中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)可以分析大樣本量細(xì)胞的特點(diǎn)簡(jiǎn)化了稀有干細(xì)胞的鑒定和分類。示例：紅系細(xì)胞分化：造血干細(xì)胞向紅系細(xì)胞分化過程中，在向紅細(xì)胞分化時(shí)中會(huì)發(fā)生收縮、進(jìn)而脫核的現(xiàn)象。同時(shí)，血型糖蛋白A的表達(dá)逐漸增加，而CD71逐漸降低。這個(gè)實(shí)驗(yàn)向我們展示的是ImageStream在將

20、強(qiáng)度、形態(tài)和定位結(jié)合起來將細(xì)胞進(jìn)行分類的獨(dú)特能力。下圖所示的是細(xì)胞核脫出的過程，利用Delta centroid XY 來衡量細(xì)胞核DRAQ5染色和血型糖蛋白A之間的位置關(guān)系。Delta centroid XY是指兩個(gè)圖像選區(qū)中心點(diǎn)間的距離。10. 毒理學(xué)：環(huán)境中的健康風(fēng)險(xiǎn)和藥物劑量評(píng)估是毒理學(xué)研究的核心問題。微核分析常用于評(píng)價(jià)候選化合物或藥物的基因毒性，這種毒性會(huì)誘導(dǎo)染色體片段化，使得在細(xì)胞分裂過程中無法分配到子代細(xì)胞中。傳統(tǒng)上，統(tǒng)計(jì)這種微核的數(shù)量要使用顯微鏡手動(dòng)進(jìn)行。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)將高速細(xì)胞成像和圖像定量分析結(jié)合起來，可以大大推動(dòng)這個(gè)研究領(lǐng)域，使得快速、自動(dòng)化鑒定細(xì)胞內(nèi)微核成為可能。示例：微核檢測(cè)：微核分析是評(píng)價(jià)藥物和其他化學(xué)試劑基因毒性的最好方法。從下面這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以看出，ImageStream僅僅使用明場(chǎng)和細(xì)胞核染色的圖像就可以快速對(duì)細(xì)胞群中凋亡、雙核和微核事件進(jìn)行分類。傳統(tǒng)上，細(xì)胞生物學(xué)家不得不在手動(dòng)熒光顯微鏡（耗時(shí)）和流式細(xì)胞術(shù)（快速分析大量細(xì)胞，但無法對(duì)胞內(nèi)細(xì)胞核成像）之間進(jìn)行選擇。Amnis量化成像流式分析系統(tǒng)將精準(zhǔn)的數(shù)字成像和分析能力結(jié)合起來，解決了這個(gè)問題。形態(tài)學(xué)參數(shù)Aspect Ratio測(cè)量圖像選區(qū)（細(xì)胞）中短軸與長軸的長度比值，尺寸參數(shù)Area測(cè)量圖像選區(qū)（細(xì)胞）面積