(上)證明力與證據(jù)能力規(guī)則演變規(guī)律探究

1、超高壓提取山茱萸中熊果酸優(yōu)化工藝研究請在此文上進行修改，并不接受修訂。請補充作者和基金項目信息。摘要：【目的】研究超高壓法提取山茱萸中熊果酸的最佳工藝條件，探討山茱萸中熊果酸提取的適宜方法?！痉椒ā吭趩我蛩卦囼灥幕A上，采用L9(34)正交試驗對超高壓提取山茱萸中熊果酸的工藝進行優(yōu)化，以熊果酸得率為指標，考察料液比(g：mL)、乙醇濃度、超高壓壓力、加壓時間對熊果酸得率的影響；同時與回流提取法和超聲提取法進行比較?！窘Y果】超高壓提取山茱萸中熊果酸的優(yōu)化工藝條件為：固液比1:22、乙醇濃度7570%、超高壓壓力320 MPa, 超高壓時間4 min，該條件下熊果酸得率可達0.322%?！窘Y論】超

2、高壓提取熊果酸得率高，提取時間短，是一種提取山茱萸中熊果酸的適宜方法。關鍵詞：超高壓；山茱萸；熊果酸；提取工藝中圖分類號:TS201.1 文獻標識碼：BStudy on extraction of ursolic acid from Cornus officlnalis seb.et zucc by ultra high pressure method Abstract: ：請根據(jù)修改后的中文摘要重新撰寫英文摘要?！綩bjective】To study the optimum ursolic acid of extracting.conditions ursolic acid from Cor

3、nus officlnalis seb.et zucc by ultra high pressure(UHP). 【Objective】Basid on signal factor test, the L9(34) orthogonal design was used to optimum UHP extraction conditions which extract ursolic acid from Cornus officlnalis seb.et zucc . Using extraction yield of ursolic acid as index, the influence

4、of solid to liquid ratio, ethanol concentration,UHP pressure, UHP time were studied, and the yield with UHP method was compared to reflux extraction method and ultrasonic wave extraction method.Ultra high pressure (UHP) method was studied and was compared to reflux extraction method and ultrasonic w

5、ave extraction method. According to the signal factor test, the L9(34) orthogonal design was used to optimum extraction conditions. Using with extraction yield of ursolic acid as index, the influence of solid to liquid ratio, ethanol concentration,UHP pressure, UHP time were studied. 【Result】Optimum

6、 extraction conditions by UHP extraction were as follows: solid to liquid ratio1:22(g:mL), ethanol75ethanol70%, UHP pressure 320Mpa and UHP time 4min, The yield of UA was 0.322%.【Conclusion】The UHP extraction method was a suitable method for it has higher yield and shorter extraction time.Key words:

7、 Ultra high pressure; Cornus officlnalis seb.et zucc.; ursolic acid; extraction 【研究意義】山茱萸( Cornus officlnalis Sieb.et Zucc.)為山茱萸科山茱萸屬小喬木（蘇秀梅，2012），其果實含有豐富的功能性成分。研究表明，山茱萸中的熊果酸具有抗氧化、降血糖等作用（楊劍芳等,2006；袁菊麗和姜紅波,2011；張茜等,2011）。因此，提取山茱萸中熊果酸成分，以開發(fā)保健食品具有廣闊的前景?！厩叭搜芯窟M展】目前，一些研究者已經研究了一些山茱萸中熊果酸的提取方法。張如新等（2008）采用超聲

8、法提取山茱萸中熊果酸成分，得到超聲波法提取山茱萸中熊果酸的最佳工藝參數(shù)為：用15倍量無水乙醇浸泡24 h，在輸入功率40%下超聲10 min, 熊果酸得率為0.86。胥佰濤等（2009）采用發(fā)酵結合超聲波輔助法提取山茱萸中的熊果酸，在30下、酵母接種量和原料質量比為3:80、搖床轉速為150 r/min時，發(fā)酵效果好,在酒精濃度85、溫度50、超聲功率100 W、時間30 min條件下提取效果最好，熊果酸得率為0.2512。阮麗紅和姜春鵬（2010）采用超微粉碎回流提取法提取山茱萸中熊果酸成分，結果發(fā)現(xiàn)較適宜的工藝條件為：粉碎粒度20m、提取溫度70、提取時間22min、乙醇體積分數(shù)85%，熊

9、果酸得率可達0.213%。張永生等（2011）通過乙醇回流提取法對山茱萸中熊果酸的提取工藝進行了優(yōu)化，得到優(yōu)化的工藝條件為乙醇濃度為75、料液比為12 mL/g、提取時間為1.5 h，熊果酸得率達0.31?！颈狙芯壳腥朦c】超高壓提取是在常溫條件下提取植物原料中有效成分的新技術，該技術具有提取時間短、能耗低、有效成分破壞小的優(yōu)點。凌慶枝等（2008）采用超高壓技術提取桑葉多糖；縱偉和李翠翠（2012）采用超高壓法在常溫下提取鐵皮石斛中的多糖成分；董海麗和劉紅（2012）采用超高壓方法提取柿葉中熊果酸。但目前超高壓技術在山茱萸中熊果酸提取的應用上仍未見報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究在單因素試驗的

10、基礎上，采用L9(34)正交試驗對超高壓提取山茱萸中熊果酸的工藝進行優(yōu)化，并且將之與回流提取法和超聲提取法進行比較，探討山茱萸中熊果酸提取的適宜方法。1 材料與方法1.1 試驗材料試驗于2011年12月于鶴壁職業(yè)技術學院食品檢測中心進行。山茱萸采于河南省西峽縣，60烘干、粉碎至20目、真空包裝備用；熊果酸對照品由中國藥品生物制品檢定所提供；乙醇試劑均為國產分析純。主要儀器包括：UHP900×2-Z超高壓處理裝置（包頭科發(fā)公司）、JY88-II超聲波細胞粉碎機（上海新芝生物技術研究所）、旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、Agilent 1100 高效液相色譜系統(tǒng)（Agilent公司）。

11、1.2 試驗方法1.2.1 超高壓提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，加入不同體積、不同濃度的乙醇溶液，混合均勻后裝入聚乙烯塑料袋中進行真空包裝，然后放入超高壓裝置的壓力腔中，高壓處理一定時間處理后過濾，3500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測定熊果酸含量，計算熊果酸得率。1.2.2 回流提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，按固液比1:20(g:mL)加入75%的乙醇溶液，加熱回流2 h后過濾，3500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測定熊果酸含量，計算熊果酸得率。1.2.3 超聲提取山茱萸中熊果酸 在山茱萸粗粉中，按固液比1:20(g:mL)加入75%的乙醇溶液

12、，采用220 W超聲處理30 min后過濾，3500 r/min離心15 min，離心后減壓濃縮，測定熊果酸含量，計算熊果酸得率。1.2.4 熊果酸的HPLC測定 參照HPLC方法測定熊果酸（楊劍芳等,2007），色譜柱：Phenomsil BDS C18，4.6 mm×200 mm，5 m ；流動相：CH3OH：H2O：HAc 為85150.3；流速：1 mL/min；柱溫：35；檢測波長：215 nm。峰面積A與熊果酸濃度C（mg/mL）之間的回歸方程為A=381.63C-3.0644（R2=0.9996）。2 結果與分析2.1 超高壓提取山茱萸中熊果酸單因素試驗2.1.1 固液

13、比對熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑， UHP壓力350 MPa下保壓4 min進行提取，不同固液比對熊果酸提取得率的影響見圖1。由圖1可知，隨著固液比中溶劑用量的增加，熊果酸的提取得率增加，但當固液比達到1:20（g：mL）后，再增加溶劑用量，熊果酸得率增加緩慢。同時，過多的溶劑用量會帶來后續(xù)濃縮強度增加的問題。因此，綜合考慮，采用固液比1:20較好。 圖1 固液比對熊果酸得率的影響橫坐標直接改為1:5，其他的一樣。Fig.1 Effect of solid to liquid ratio on the yield of ursolic acid 2.1.2 乙醇濃度對熊果酸提

14、取得率的影響 采用不同濃度的乙醇溶液為溶劑，固液比1:20（g：mL）、UPH壓力350 MPa下保壓4 min進行提取，乙醇濃度對熊果酸提取得率的影響見圖2。由圖2可知，隨著乙醇濃度的增加，熊果酸的提取得率增加，但當乙醇濃度達到70%后，再增加乙醇濃度，熊果酸得率反而下降。這是由于按相似相溶原理，溶劑的極性與熊果酸相當，則熊果酸溶解度最大。70%乙醇溶液的極性與熊果酸相當，乙醇濃度過小或過大，則溶劑的極性與熊果酸不相當。 圖2 乙醇濃度對熊果酸得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of ursolic acid2.1.

15、3 UHP壓力對熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑，固液比1:20（g：mL），在不同UHP壓力下保壓4 min進行熊果酸提取，UHP壓力對熊果酸提取得率的影響見圖3。由圖3可知，隨著UHP壓力的增加，熊果酸的提取得率增加，但當UHP壓力達到300 MPa后，再增加壓力，熊果酸得率反而下降。這是由于超高壓提取的過程是加壓后造成細胞破裂，使內容物溶出，在300 Mpa時，細胞破裂，熊果酸溶出增加；再繼續(xù)增加壓力，細胞過度破裂，造成細胞中其他雜質過多溶出，有效成分的傳質速率降低，影響熊果酸游離到細胞外。因此，UHP壓力為300 MPa時提取熊果酸較好。 圖3 壓力對熊果酸得率的影響 F

16、ig.3 Effect of UHP pressure on the yield of ursolic acid2.1.4 保壓時間對熊果酸提取得率的影響 采用70%乙醇溶液為溶劑，固液比1:20（g：mL），在UHP壓力300MPa下保壓不同時間進行熊果酸提取，保壓時間對熊果酸提取得率的影響見圖4。由圖4可知，隨著保壓時間的增加，熊果酸提取得率增加，但當保壓時間達到4 min后，再繼續(xù)增加保壓時間，熊果酸得率增加緩慢。這是由于超高壓提取過程就是加壓后造成細胞破裂，使內容物溶出。本研究中，保壓4 min時細胞已經破裂，熊果酸和周圍溶劑之間達到傳質平衡，再增加保壓時間，熊果酸得率基本不變。因此，

17、保壓時間為4 min時熊果酸提取效果較好。 圖4 保壓時間對熊果酸得率的影響 Fig.4 Effect of UHP time on the yield of ursolic acid2.2 熊果酸提取工藝條件的優(yōu)化在單因素試驗的基礎上，選用L9(34)正交試驗表，以熊果酸得率為指標，考察固液比、乙醇濃度、UHP壓力、UHP時間對熊果酸得率的影響，試驗設計和結果分別見表1和表2。由表2極差分析結果可知，各因素對熊果酸得率的影響程度依次為：DCBA，即UHP時間UHP壓力乙醇濃度固液比。優(yōu)化的提取條件為 A3B3為何不是B1，此外，請補充此工藝條件下熊果酸的得率。C3D2A3B1C3D2,即：U

18、HP時間4min、UHP壓力320Mpa、乙醇濃度7570%、固液比1:22。在此工藝條件下進行驗證試驗，熊果酸的得率為0.322%。為何要突然出現(xiàn)此句話？且山茱萸的用量應是在試驗材料中就應說明。 表1 因素與水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal test因素/水平Factors/levels(A)固液比(g/mL) solid to liquid ratio(B) 乙醇濃度（%）ethanol concentration(C)UHP壓力(MPa) pressure(D)UHP時間 (min) time11:18652803.521:2070300

19、4.031:22753204.5 表2 正交試驗結果 Tab.2 Result of orthogonal test編號number(A)固液比(g/mL) solid to liquid ratio(B) 乙醇濃度（%）ethanol concentration(C)UHP壓力(MPa) pressure(D)UHP時間 (min) time得率(%)yield11:18652803.50.22121:18703004.00.31831:18753204.50.30441:20653004.50.26251:20703203.50.26761:20752804.00.28471:226532

20、04.00.31281:22702804.50.27191:22753003.50.289k10.2810.2650.2590.259k20.2710.2850.2900.305k30.2910.2920.2940.279R0.0200.0270.0350.046對表2的試驗結果進行方差分析和F檢驗，F(xiàn)檢驗結果（表3）表明，UHP時間和UHP壓力對熊果酸得率在所考察的范圍內影響顯著,而乙醇濃度和固液比對熊果酸得率在所考察的范圍內影響均不顯著。表3 方差分析結果Tab.3 Result of variance analysis因素 factors偏差平方和sum of square自由度free

21、domF/F0.05 顯著性significanceA0.00120.571不顯著(no)B0.00120.571不顯著(no)C0.00221.143顯著(yes)D0.00321.714顯著(yes)誤差error0.018采用山茱萸2 kg，按上述最佳條件進行驗證實驗，熊果酸得率為0.322%。為何要突然出現(xiàn)此句話？且山茱萸的用量應是在試驗材料中就應說明。2.3 不同提取方法熊果酸提取得率比較將山茱萸分別采用超高壓、回流和超聲法進行提取，比較提取后熊果酸得率和提取所用的時間可知，3種不同的提取方法中，超高壓法熊果酸提取得率不僅高，且提取時間短（表4）。 表4 3種方法提取山茱萸中熊果酸的

22、得率和提取時間 Tab 4. Compare of extraction yield and time of three methods 方法method超高壓提取法ultra high pressure method回流提取法reflux extraction超聲提取法ultrasonic extraction 得率(%)yield0.3220.3150.287時間(min) time4120303 討論山茱萸是一種資源豐富的藥食兩用植物資源，是開發(fā)保健食品的較好原料，對其活性成分熊果酸的分離提純及藥理學進行深入研究，開發(fā)精制、深加工轉化產品是其發(fā)展方向。目前，山茱萸熊果酸最常用的提取方法是

23、回流法，該方法對設備條件要求不高，操作方法簡單，但熊果酸提取率不高，且提取時間長；通過采用超聲強化提取可提高其得率，縮短時間，但超聲容易造成有效成分破壞，且提取時間仍然需要30 min以上；超微粉碎法通過對細胞進行破壞，提高提取熊果酸提取得率，但其對細胞的破壞程度有限，得率仍有待提高。本研究采用的超高壓提取法，其是通過加壓破壞山茱萸細胞，促進熊果酸溶出，在提取過程中，細胞在壓力作用下被破壞，但由于為非熱提取，熊果酸破壞小，且提取過程中細胞在幾分鐘內即被破壞，提取時間極大縮短，得率得到提高。4 結論采用超高壓法提取山茱萸中熊果酸的優(yōu)化工藝條件為固液比1:22、乙醇濃度7570%、UHP時間4 m

24、in、UHP壓力320 MPa，熊果酸得率可達0.322%，具有提取時間短、得率高的特點，在提取山茱萸中熊果酸中具有很好的應用前景。參考文獻：根據(jù)我刊要求，應將所有作者羅列出來，并修改英文。董海麗,劉紅.2012.超高壓提取柿葉中熊果酸工藝條件的優(yōu)化J.湖北農業(yè)科學,16: 3567-3569.Dong H L. Liu H.2012. Optimization for utra hgh pessure etraction of usolc aid in dospyros kaki L.f. laves J.Hubei Agricultural Sciences,16: 3567-3569.凌

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26、d from cornus offtcinalis by wet ultrafine grinding technolioyJ.Hubei Agricultural Sciences, 10:2521-2523.蘇秀梅. 2012.吳茱萸與山茱萸的鑒別J.海峽藥學, (03) :44-45Shu X M.2012. Dsting of tetradium ruticarpum and cornus offtcinalis J.Strait Pharmaceutical Journal., (03) :44-45胥佰濤,何國慶,李心泓, 海寧 沈生榮等.2009.超聲波輔助法提取山茱萸發(fā)酵產物中

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29、測定山茱萸及其浸泡酒中熊果酸和齊墩果酸總量J. 釀酒科技,2007,11:100-103. Yang J F, Lu F P, Gao W Y, Huang M. Y.et al.等.2007.Determination of the total amount of ursolic acid and oleanolic acid in cornus officinalis and its steeping wine by HPLC J. Liquor-making Science& Technology,2007,11:100-103. 袁菊麗,姜紅波.2011.山茱萸的主要化學成分及藥理作用J.化學與生物工程,28(5):7-9Yuan J L,Jiang H B.2011. Main chemical composition and pharmacological effect of cornus officinalis J.Chemistry & Bioengineering,28(5):7-9張茜,朱亞利,張德甫, 胡巧云等.2011. 山茱萸