ipt基因促進(jìn)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化不定芽再生_圖文

1、第33卷第6期2011年11月北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITYVol33，No6Nov，2011550025貴州省貴陽市花溪區(qū)貴州大學(xué)南校區(qū)農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。責(zé)任作者：趙德剛，教授，博士生導(dǎo)師。主要研究方向：植物基因工程。電話mail ：dgzhaoyahoocom地址：同上。本刊網(wǎng)址：http ：journalbjfueducnipt 基因促進(jìn)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化不定芽再生李巖趙德剛（貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院基因工程實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)教育部綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）摘

2、要：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的ipt 基因遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，分析ipt 基因?qū)Χ胖龠z傳轉(zhuǎn)化不定芽誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)ipt 基因及空載體，外植體不定芽的分化率分別為0. 96%和0. 93%，差別不明顯，但轉(zhuǎn)ipt 基因的單位外植體平均長芽數(shù)為3. 1個(gè)，明顯高于對(duì)照的1. 9個(gè)，進(jìn)而促進(jìn)了杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的不定芽的誘導(dǎo)，其不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)2. 95%，明顯高于空載體對(duì)照的1. 68%。本文首次證明：ipt 基因能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化困難木本植物杜仲的不定芽誘導(dǎo)，為通過該基因與其他功能基因結(jié)合提高杜仲遺傳轉(zhuǎn)化效率奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因；遺傳轉(zhuǎn)化；杜仲中圖分類號(hào)：Q943.

3、2；S723. 1+32文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1000-1522（2011）06-0090-04LI Yan ；ZHAO De-gang. Ipt gene promoting shoot regeneration in genetic transformation of Eucommia ulmoides OlivJournal of Beijing Forestry University （2011）33（6）90-93Ch ，11refGuizhou Key Laboratory of Agro-Bioengineering ，Laboratory of Gene Engineeri

4、ng in College of Life Sciences of Guizhou University ，Key Laboratory of Green Pesticide and Agricultural Biological Engineering of Ministry of Education ，Guiyang ，550025，PRChinaIn this research ，the ipt gene driven by 35S promoter was transferred into Eucommia ulmoides Olivvia agrobacterium-mediated

5、 transformation ，and the influence of exogenous gene on shoot regeneration was further investigated in the current workThe results showed that compared with control （ipt -free ）line （0. 93%），no significant difference in shoot regeneration efficiency was obtained from the ipt transgenic lines （0. 96%

6、）However ，ipt gene enhanced the shoot number per explant ，which was 3. 1，obviously higher than that of control （1. 9）Thus ipt gene enhanced shoot inductivity of Eulmoides ，which was 2. 95%，evidently high than CK 1. 68%The present research firstly prove that ipt gene can substantially enhance shoot r

7、egeneration of Eulmoides and this lays a foundations for promoting genetic transformation efficiency of Eulmoides Key wordsipt gene ；genetic transformation ；Eucommia ulmoides Oliv杜仲（Eucommia ulmoides Oliv）系杜仲科（Eucommiaceae ）杜仲屬植物，為我國特有的珍稀保護(hù)樹種，已列入中國植物紅皮書（稀有瀕危植物）第1卷。杜仲既是傳統(tǒng)名貴中藥，也是溫帶最具開發(fā)利用前景的膠源植物。杜仲的遺傳轉(zhuǎn)

8、化較為困難，目前僅有趙丹等1關(guān)于FPS 基因遺傳轉(zhuǎn)化杜仲的研究報(bào)道。異戊烯基轉(zhuǎn)移酶（IPT ）催化細(xì)胞分裂素生物合成途徑中DMAPP （2'-異戊烯基焦磷酸）和5'-AMP （5'-腺苷-磷酸）縮合和去磷酸化反應(yīng)，產(chǎn)生異戊烯基單磷酸腺苷，是細(xì)胞分裂素生物合成最重要的限速酶2-3之一。ipt 基因來源于根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒，編碼細(xì)胞分裂素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶即異戊烯基轉(zhuǎn)移酶，它能促進(jìn)煙草（Nicotiana tabacum ）、矮牽牛（Petunia hybrida ）等植物遺傳轉(zhuǎn)化過程的不定芽誘導(dǎo)，提高轉(zhuǎn)化效率4-7本文擬將ipt基因遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，探討ipt 基因?qū)Χ胖?/p>

9、遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響，為利用ipt 基因提高杜仲轉(zhuǎn)化效率奠定基礎(chǔ)。1材料與方法1. 1供試材料根癌農(nóng)桿菌，菌株EHA105為本實(shí)驗(yàn)室保存。ipt 基因植物表達(dá)載體由本實(shí)驗(yàn)室以pBin19為基礎(chǔ)構(gòu)建，表達(dá)載體圖譜T-DNA 部分見圖1。遺傳轉(zhuǎn)化中所用植物材料杜仲取自貴州大學(xué)校園。實(shí)驗(yàn)中所用PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下：ipt P1：5'-ATCGGGTCCAAT GCTGTCCTC-3' ；ipt P2：5'-TGCTTAACTCTGGCC TTGGC-3' ，flp P1：5'-GGGGTACCCAAGTCGACC AATG

10、CCACAATTTGGTATATTATG-3' ，flp P2：5'-CCGATCGAGTTATAT GCGTCTATTTATGTAGG-3' 。圖1植物表達(dá)載體T-DNA 結(jié)構(gòu)圖Fig. 1Constructs for plant expression vector T-DNA1. 2農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化杜仲種子去外皮，沖洗30min ，滅菌水浸泡過夜，超凈工作臺(tái)中以75%酒精消毒60s ，0. 1%升汞消毒30min ，無菌水漂洗5次。將消毒后的種子接種到MS 基本培養(yǎng)基中。待種胚突破種皮0. 5cm 左右時(shí)，將胚剝出，接種到種胚生長培養(yǎng)基中。取20d 齡種胚，將胚

11、軸切成0. 5cm 左右小段，置于分化培養(yǎng)基，黑暗預(yù)培養(yǎng)48 72h ，將預(yù)培養(yǎng)的外植體投入預(yù)先準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌重懸液中，室溫下不斷搖動(dòng)，使外植體與農(nóng)桿菌充分接觸，浸泡6 8min ，取出外植體，置于干燥無菌濾紙上吸去多余的菌液，共 培養(yǎng)48h ，此時(shí)外植體邊緣及培養(yǎng)基開始長出農(nóng)桿菌菌落，將材料用濾紙蘸凈，轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基誘導(dǎo)不定芽分化。28d 后比較不同材料的不定芽誘導(dǎo)情況，計(jì)算外植體分化率、外植體平均長芽數(shù)及遺傳轉(zhuǎn)化效率（不定芽誘導(dǎo)率）。外植體分化率=長芽外植體數(shù)/外植體總數(shù) 100%，外植體平均長芽數(shù)=不定芽總數(shù)/長芽外植體數(shù)，遺傳轉(zhuǎn)化效率（不定芽誘導(dǎo)率）=不定芽總數(shù)/外植體總數(shù) 100%。

12、實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基成分見表1。除特殊說明以外，實(shí)驗(yàn)中所用植物培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)+30g /L 蔗糖+7g /L 瓊脂，pH 5. 80，121 滅菌20min 。表1杜仲遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基Tab. 1Media used for genetic transformation in E . ulmoides培養(yǎng)基號(hào)培養(yǎng)基名稱培養(yǎng)基組成1種胚生長培養(yǎng)基MS +2. 0mg /L GA +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%2預(yù)培養(yǎng)基MS +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%3共培養(yǎng)基MS +0. 8mg /L 6-BA +0. 1mg /L NAA +50mg /L AS +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%4篩選培養(yǎng)基1M

13、S +0. 8mg /L BAP +0. 1mg /L NAA +50mg /L Kan +100mg /L Timentin +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75% 5篩選培養(yǎng)基21. 0mg /L 6-BA +0. 1mg /L NAA +50mg /L Kan +100mg /L Timentin +蔗糖3%+瓊脂粉0. 75%1. 3轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)以CTAB 法提取杜仲葉片總DNA 。因植物表達(dá)載體的T-DNA 中含有flp 基因，分別采用flp 重組酶基因特異引物flp Primer 1和flp Primer 2，以及ipt 基因特異引物ipt Primer 1和ipt Primer 2，

14、進(jìn)行PCR 擴(kuò)增檢測(cè)。flp 基因PCR 擴(kuò)增條件為：94 預(yù)變性10min ；94 變性1min ，55 退火1min ，72 延伸1min ，共35個(gè)循環(huán)；最后72 延伸7min 。ipt 基因PCR 擴(kuò)增條件為：擴(kuò)增條件為94 10min ；94 1 min ，58 1min ；72 1min ，共35個(gè)循環(huán)；最后72 延伸7min 。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 0%的瓊脂糖中進(jìn)行電泳檢測(cè)。 2結(jié)果分析2. 1轉(zhuǎn)基因杜仲flp 基因PCR 分析電泳檢測(cè)結(jié)果表明（圖2），第5 6道轉(zhuǎn)化Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲芽及第4道轉(zhuǎn)化Hsp 18. 2：flp 杜仲芽均擴(kuò)增出12

15、70bp 的帶，與第3道陽性質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物大小一致，而非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諞]有擴(kuò)增出特征譜帶。2. 2轉(zhuǎn)基因杜仲ipt 基因PCR 分析電泳檢測(cè)結(jié)果表明（圖3），第5、6道轉(zhuǎn)化Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲芽擴(kuò)增出了325bp 的帶，與第1道Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 陽性質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物大小 圖2轉(zhuǎn)基因杜仲flp 基因PCR 分析Fig. 2PCR analysis of transgenic E . ulmoides with flp gene注：1. 標(biāo)準(zhǔn)DNA ：DNA 經(jīng)BamH ，Hind 雙酶切產(chǎn)物；2. 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?. Hsp 18. 2：flp -

16、35S ：ipt 質(zhì)粒；4. 轉(zhuǎn)Hsp 18. 2：flp 杜仲轉(zhuǎn)基因植株；5 6. 轉(zhuǎn)Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲轉(zhuǎn)基因植株。圖3轉(zhuǎn)基因杜仲ipt 基因PCR 分析Fig. 3PCR analysis of transgenic E . ulmoides with ipt gene注：1Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 質(zhì)粒；2標(biāo)準(zhǔn)DNA ：100bp DNA Ladder ；3非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?轉(zhuǎn)Hsp 18. 2：flp 杜仲轉(zhuǎn)基因植株；5 6轉(zhuǎn)Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 杜仲轉(zhuǎn)基因植株。一致，而轉(zhuǎn)化Hsp 18. 2：flp 杜仲

17、芽及對(duì)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諞]有擴(kuò)增出特征譜帶。2. 3ipt 基因?qū)Χ胖倥咻S遺傳轉(zhuǎn)化不定芽誘導(dǎo)的影響 圖4杜仲遺傳轉(zhuǎn)化Fig. 4Genetic transformation of E . ulmoides注：1. 遺傳轉(zhuǎn)化Hsp 18. 2：flp 基因杜仲胚軸不定芽誘導(dǎo)；2. 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩胖倥咻S不定芽誘導(dǎo)；3. 遺傳轉(zhuǎn)化Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 基因杜仲胚軸不定芽誘導(dǎo)；4. 轉(zhuǎn)Hsp 18. 2：flp 基因杜仲植株試管苗；5. 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ斩胖僦仓暝嚬苊纾?. 轉(zhuǎn)Hsp 18. 2：flp -35S ：ipt 基因杜仲植株試管苗。由表2，圖4可知，轉(zhuǎn)化ipt 基因杜仲胚軸

18、外植體分化率略高于轉(zhuǎn)化空載體對(duì)照材料，但差別不明顯，分別為0. 96%和0. 93%。但在單個(gè)外植體誘導(dǎo)芽密度上，遺傳轉(zhuǎn)化ipt 的轉(zhuǎn)基因材料明顯高于空載體材料及對(duì)照，其單個(gè)外植體平均誘導(dǎo)抗性芽數(shù)為3. 1，顯著高于轉(zhuǎn)化空載體對(duì)照的1. 9個(gè)及非轉(zhuǎn)基因?qū)φ詹牧系?. 0個(gè)，進(jìn)而提高了杜仲胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)化ipt 基因胚軸轉(zhuǎn)化效率為2. 95%，明顯高于對(duì)照的1. 68%，而未經(jīng)卡那霉素篩選的非轉(zhuǎn)基因杜仲胚軸的不定芽誘導(dǎo)率為29. 81%，篩選材料未見不定芽分化?？梢奿pt 基因?qū)Χ胖倥咻S遺傳轉(zhuǎn)化中的不定芽誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用。表2轉(zhuǎn)植基因?qū)Χ胖倥咻S不定芽誘導(dǎo)的影響Tab. 2Sho

19、ot inducement ratio of hypocotyls of Eulmoides transformed with Hsp18. 2：flp -35S ：ipt gene轉(zhuǎn)基因類型外植體分化率/%單個(gè)外植體長芽情況平均單個(gè)外植體長芽數(shù)不定芽誘導(dǎo)率/%Hsp18. 2：flp 0. 931 51. 91. 68Kan +Hsp18. 2：flp -35S ：ipt 0. 962 73. 12. 95Kan +對(duì)照未篩選15. 201 52. 029. 81對(duì)照經(jīng)篩選00003結(jié)論與討論杜仲是遺傳轉(zhuǎn)化較困難的植物，研究組已獲得農(nóng)桿菌介導(dǎo)的杜仲遺傳轉(zhuǎn)化專利授權(quán)，但轉(zhuǎn)化效率不高。本研究利用

20、ipt 基因遺傳轉(zhuǎn)化杜仲獲得轉(zhuǎn)基因杜仲芽，首次證明ipt 基因能夠提高轉(zhuǎn)化困難植物杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化效率，這與之前報(bào)道的在煙草、矮牽牛等植物中的研究結(jié)果一致4-7。因此ipt 基因可用于杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化，提高遺傳轉(zhuǎn)化效率。在遺傳轉(zhuǎn)化外植體的選擇上，杜仲胚軸或子葉均可作為外植體誘導(dǎo)不定芽再生，但誘導(dǎo)率胚軸高于子葉8，因此在本研究中采用胚軸為外植體進(jìn)行杜仲遺傳轉(zhuǎn)化計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。雖然ipt 基因能夠促進(jìn)植物遺傳轉(zhuǎn)化中的不定芽誘導(dǎo)，但其表達(dá)可增加轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞分裂素含量，引起植物的非正常變化7，9-10。研究采用基因構(gòu)建中包含熱激啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)重組酶基因flp 的基因刪除表達(dá)元件，可在ipt 基因發(fā)生作用后通過熱激處理將其刪除，避免對(duì)植物生長發(fā)育帶來的負(fù)面影響。目前，杜仲基因刪除工作正在進(jìn)行中。參考文獻(xiàn)1趙丹，趙德剛，李巖EuFPS 基因表達(dá)載體構(gòu)建及對(duì)杜仲遺傳轉(zhuǎn)化的研究J . 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2009，28（1）：2