耐鹽乳酸菌的篩選和鑒定

1、耐鹽乳酸菌的篩選和鑒定摘要：本實(shí)驗(yàn)從醬油廠提供的醬油原醅中分離篩選出耐鹽乳酸菌，該菌在18%以上NaCl 濃度的條件下能夠正常生長代謝，初步鑒定其為四聯(lián)球菌屬，可用于高鹽稀醪醬油釀造目前國內(nèi)尚無耐鹽度達(dá)18%的乳酸菌種, 該菌種的成功選育為國內(nèi)首創(chuàng)。關(guān)鍵詞 乳酸菌 耐鹽 篩選 鑒定醬油采用高鹽稀醪發(fā)酵工藝生產(chǎn)時(shí)能有更好的質(zhì)量和香味。其工藝上需要在醬醅發(fā)酵過程中添加酵母菌和乳酸菌。然而醬油的含鹽度高達(dá)18%， 這就需要選育出耐鹽菌種。關(guān)于耐鹽酵母的應(yīng)用報(bào)道已有很多。而乳酸菌方面，目前在國內(nèi)菌種庫內(nèi)尚無耐鹽度達(dá)18%的菌種。我們作為醬油大國，篩選出耐鹽度達(dá)18%的嗜鹽乳酸菌的意義則顯得十分重大。本

2、實(shí)驗(yàn)主要對(duì)高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝醬醅中嗜鹽乳酸菌進(jìn)行分離篩選及鑒定。1 材料與方法1.1 材料醬醅 、草酸銨結(jié)晶紫液（革蘭氏A液）、路哥爾氏碘液（革蘭氏B液）、蕃紅花紅（沙黃）、生理鹽水。1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 分離篩選流程(如圖1)1.2.2 篩選方法十倍稀釋法、平板涂布法、斜面之字劃線法、平板四分法劃線。1.2.3 鑒定方法1.2.3.1 革蘭氏染色法1.2.3.2 過氧化氫酶接觸酶測定取一環(huán)瓊脂斜面的培養(yǎng)物，涂于干凈載玻片上，然后加1 滴3% -15% H2O2，若有氣泡產(chǎn)生則為陽性反應(yīng)，無氣泡為陰性反應(yīng)?；?qū)?%-15% H2O2加到斜面的菌苔上觀察是否有氣泡的產(chǎn)生。1.2.3.3 生化

3、鑒定管使用方法挑取待檢菌革蘭氏染色鏡檢，將新鮮菌苔接種于普通肉湯中，37攝氏度培養(yǎng)18-24h。各吸取0.05-0.08ml（約1-2滴）的肉湯培養(yǎng)物或菌懸液加入每種微量生化管內(nèi)，將已接種生化管套上無菌塑料帽直立于三折吸塑短架內(nèi)，于35-37攝氏度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.2.3.4 高效液相色譜HPLC 測量乳酸含量(圖2)2 結(jié)果與討論2.1 耐鹽乳酸菌的篩選 富集培養(yǎng)分離初篩(如圖3)耐鹽度能達(dá)10%以上的乳酸菌基本都在片球菌屬和四聯(lián)球菌屬這二個(gè)屬內(nèi)。而四聯(lián)球菌的耐鹽度更高達(dá)18%以上，所以我們分離篩選的目標(biāo)在四聯(lián)球菌上。四聯(lián)球菌的菌落為乳白色，成小圓點(diǎn)狀。顯微鏡下觀察，菌體四聯(lián)或成對(duì)，極少成單

4、。這便是我們初篩時(shí)的重要依據(jù)。用富集培養(yǎng)基取代分離培養(yǎng)基對(duì)醬油曲進(jìn)行培養(yǎng)在這樣的條件下培養(yǎng)。兩天后平板上出現(xiàn)的菌落有不少類似于乳酸菌。將鏡檢為球菌的菌落挑出，進(jìn)行液體培養(yǎng)。然后從中篩選出具有四聯(lián)形態(tài)的菌種。 菌種的純化（復(fù)篩）將初篩菌種在含15%NaCl濃度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)在培養(yǎng)過程中定期鏡檢，觀察菌種的生長狀況。生長4天后,進(jìn)行平板涂布、之字形劃線以及平板四分法劃線分離。然后從經(jīng)培養(yǎng)后的平板和斜面上挑出鏡檢為四聯(lián)球菌特征的菌落繼續(xù)培養(yǎng)。如此反復(fù)，直到確定其為單一菌株為止。最后在OLYMPUS BX51 型正置照相顯微鏡下的觀察。對(duì)菌種進(jìn)行保藏。2.2 耐鹽乳酸菌的鑒定 菌落形態(tài)待鑒定菌的菌

5、落形態(tài)，成乳白色，油脂狀。在30攝氏度pH約7.0的液體培養(yǎng)基和瓊脂平板或斜面上均能正常生長。 革蘭氏染色和過氧化氫酶測定對(duì)所篩菌種做革蘭氏染色，成陽性反應(yīng)。利用電子顯微鏡對(duì)菌種拍照如圖9。2.2.3 pH 值對(duì)待鑒定菌種生長的影響在片球菌與氣球菌的鑒別上，pH值是一個(gè)重要的區(qū)分因素。片球菌在pH5下能生長，而氣球菌則不能；在pH9.0的情況則正好相反。本實(shí)驗(yàn)分別做了液體培養(yǎng)基初始 pH=4.5和9.0下的生長情況記錄。乳酸菌在其生長過程中會(huì)產(chǎn)生乳酸、醋酸等有機(jī)酸，從而降低培養(yǎng)基的pH值。而當(dāng)pH值降低到一定程度后，又會(huì)反過來抑制乳酸菌的生長。從表2 可看到在培養(yǎng)基初始pH=4.5的情況下，該

6、菌種還能生長，但從第二天開始，生長則變得比較緩慢。所以，可得出結(jié)論：待鑒定菌是可以在pH =5.0下生長的。由于沒能找到能有效維持液體培養(yǎng)基 pH值在9.0的緩沖溶液，所以，即使初始pH為9.0， 但伴隨著極少數(shù)乳酸菌的生長代謝，溶液pH 值也將不斷下降，從而使其逐漸變得適合該菌生長。所以初始pH =9.0的這組生長記錄數(shù)據(jù)不能取用。但我們可以從表中看到從第四天到第六天，OD600 值有很大的提高。驗(yàn)證了前面培養(yǎng)基會(huì)逐漸變得適合菌種生長的推斷。基于以上數(shù)據(jù) 我們判斷待鑒定菌為片球菌屬。3 結(jié)論3.1 酪蛋白水解物具有明顯促進(jìn)酸奶發(fā)酵的作用。隨水解物添加量增加，促進(jìn)發(fā)酵程度提高1.5%-2.0%添加量的水解物對(duì)酸奶的促發(fā)酵效果接近。3.2 添加酪蛋白水解物改變了酸奶發(fā)酵過程中的pH下降：速度添加樣在發(fā)酵前4h的pH下降速度高于空白樣，而發(fā)酵4h后空白樣的pH 降速度略快；發(fā)酵中期，二者的pH下降速度存在最大差距。3.3 不同水解程度的酪蛋白水解物 ，在對(duì)酸奶的促發(fā)酵程度上，表現(xiàn)出隨水解程度增加，促發(fā)酵程度提高除2h水解物的促發(fā)酵程度較小外，8h