高分子在葡萄糖檢測中的應(yīng)用

1、 高分子在葡萄糖檢測中的應(yīng)用 摘要 本文的主要目的在于：一是闡述幾種葡萄糖的檢測原理；二是在材料領(lǐng)域列舉一些最近研究過的用作葡萄糖檢測的高分子，并簡單介紹其在檢測過程中的發(fā)揮的作用?？偟膩碚f，本文是一篇以前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)的綜述性概括。關(guān)鍵詞 高分子，葡萄糖檢測引言 葡萄糖作為一項(xiàng)人體的生化指標(biāo)，其檢測一直備受關(guān)注。長期以來，在研究人員不斷的努力下，產(chǎn)生各式各樣的檢測原理。在已有檢測原理的基礎(chǔ)之上，人們又不斷尋求反應(yīng)時間更快，檢測時間更短，靈敏度更高的方法。但優(yōu)異的功能需要有良好的物質(zhì)材料作為依托，高分子這個領(lǐng)域就為其發(fā)展提供了廣闊的空間。千變?nèi)f化的高分子材料為我們提供了許許多多的選擇，我們總

2、能在其中找出一種或幾種滿足需求的。近年來，已有不少的研究工作在這一方面取得了進(jìn)展，為高分子應(yīng)用于葡萄糖檢測奠定了理論基礎(chǔ)。 1、 常見葡萄糖檢測原理 1.1菲林試劑還原法說到葡萄糖檢測方法，真可謂層出不窮。菲林試劑還原法是大家都比較熟悉的用于檢測尿糖的方法。菲林試劑由甲乙兩種溶液混合而成，甲液是硫酸銅，乙液是氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的混合液。兩者混合后生成的氫氧化銅沉淀在酒石酸鉀鈉存在的情況下與葡萄糖作用，在加熱的條件下能生成磚紅色氧化亞銅沉淀，由此鑒定葡萄糖的有無。當(dāng)然，這種檢測方法針對的是還原性糖，即凡是具有還原性的糖都能與菲林試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，因此該方法對葡萄糖的檢測沒有特異性。 1.2熒光

3、法1葡萄糖能使熒光染料(3-5-(4-二甲氨基苯基)-4,5-二氫啞唑-2-苯磺酰胺基苯硼酸)的熒光發(fā)生淬滅。在磷酸緩沖液pH=9.0，ex=362nm，em=573nm條件下測定，最低檢測限為5*10-6molL-1。此法用于測定血清中的葡萄糖。 1.3酶法1酶比色法葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下產(chǎn)生過氧化氫，過氧化氫在辣根過氧化物酶的催化作用下使熒光素產(chǎn)生褪色，熒光素在490nm處有很強(qiáng)的吸收，以空白Ao值減去各標(biāo)準(zhǔn)溶液的A值，作葡萄糖濃度A工作曲線，計(jì)算葡萄糖含量。1.3.2酶熒光法以硫胺素為熒光底物的葡萄糖熒光分析方法，固定化酶柱催化氧化葡萄糖而生成過氧化氫，生成的過氧化氫又被辣根過氧化

4、物酶催化氧化硫胺素生成硫胺熒，硫胺熒的激發(fā)波長在375nm，發(fā)射波長在440nm，熒光強(qiáng)度與葡萄糖濃度成正比。此方法用于測定血清中的葡萄糖，檢測限為0.15mgL-1。1.3.3酶電極法葡萄糖氧化酶在有氧條件下催化-D-葡萄糖（葡萄糖水溶液狀態(tài)）氧化，生成D-葡萄糖酸-內(nèi)酯和過氧化氫。過氧化氫與過氧化氫型電極接觸產(chǎn)生電流。該電流值與-D-葡萄糖的濃度呈線性比例，在酶電極葡萄糖分析儀上直接顯示葡萄糖含量，最低檢出限量為1.0mg/100ml?；陔姌O法的葡萄糖傳感器研究較多，酶的固定化方法很多，如吸附法、載體偶聯(lián)法、交聯(lián)法和包埋法等。除了上述所列舉的幾種檢測方法外，還有光散射法、近紅外光譜法、脈

5、沖電伏安法等等?？傊?，現(xiàn)在不缺乏葡萄糖的檢測方法，我們需要做的是如何優(yōu)化檢測手段，使之能夠快速而又準(zhǔn)確的測定葡萄糖含量。2、 高分子在葡萄糖檢測中的應(yīng)用 2.1以苯硼酸為基礎(chǔ)的葡萄糖檢測高分子 近幾年來，由于苯硼酸在針對糖尿病治療的胰島素自調(diào)控釋放結(jié)構(gòu)的潛在應(yīng)用，以苯硼酸為基礎(chǔ)的葡萄糖響應(yīng)高分子材料已經(jīng)引起了極大注意。 Siddiq等人2制備出了一種帶有4VP并以苯硼酸為基礎(chǔ)的微凝膠，能夠在生理pH和正常體溫下與葡萄糖發(fā)生作用。4VP與苯硼酸的結(jié)合能夠顯著地降低本硼酸的pKa,依靠的是路易斯酸堿的相互作用；此外還能夠提高體積相轉(zhuǎn) 圖（1）變溫度。因此這種復(fù)合結(jié)構(gòu)能在生理pH和正常體溫條件下提高

6、葡萄糖檢測的靈敏度。為了進(jìn)一步降低葡萄糖檢測時的pH值，Sumerlin3和他的同事報道了一種包含苯硼酸的嵌段共聚物，其pKa為8.2。該嵌段共聚物由N,N-二甲基乙酰胺和帶有丙烯酰胺的硼酸單體經(jīng)RAFT聚合而成。在pH低于8.2時，嵌段共聚物能自組裝成聚集態(tài)。通過加堿使其pH>pKa或者在pH為7.4的條件下加入葡萄糖都會致使聚集態(tài)分解。這種特性有希望在生理?xiàng)l件下實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放。 圖（2）除了微凝膠和自組裝在葡萄糖檢測上有應(yīng)用外，最近也有基于苯硼酸的自組裝囊泡被報道出作為載體來檢測傳感葡萄糖。Van Hest等人4設(shè)計(jì)了一種利用糖分子響應(yīng)的嵌段共聚物來誘發(fā)控制滲透的聚合物囊泡納米反

7、應(yīng)器。他們發(fā)明了一種很簡單的方法來使聚合物囊泡產(chǎn)生膜滲透的能力，該聚合物囊泡中含有常見的兩親性嵌段共聚物，PEG-b-PS。他們這種設(shè)計(jì)方法的關(guān)鍵步驟在于使用刺激響應(yīng)的嵌段共聚物作為小孔生成的成分。他們合成了一系列的糖響應(yīng)的嵌段共聚物，如PEG-b-PSBA，2b-4b等。合成手段采用ATRP，用特己酮作為保護(hù)劑的乙烯基本硼酸，通過PEG大分子引發(fā)劑起始反應(yīng)，之后移除特己酮即可。 圖（3） PEG-b-PSBA自組裝成囊泡之后可以在升高pH和加入糖分子的情況下分解成可溶性的嵌段共聚物。當(dāng)同時使用嵌段共聚物PEG-b-PSBA和PEG-b-PS時，聚合物囊泡便獲得了可控滲透的性質(zhì)。這歸功于PS和

8、PSBA不混溶，使得在相分離的囊泡膜上能有刺激響應(yīng)PSBA的區(qū)域。這種聚合物囊泡已成功作為封裝酶的納米反應(yīng)器，其中的PSBA區(qū)域成為小分子物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的小孔通道。 2.2過氧化聚吡咯在葡萄糖傳感中的應(yīng)用5聚吡咯，一種常見的導(dǎo)電聚合物，已被廣泛應(yīng)用于電化學(xué)傳感器和生物傳感器。在傳感檢測中雜離子的干擾是不可避免的，但利用過氧化聚吡咯能夠一定程度上解決這個問題，這也是該高分子化合物被廣泛使用的原因。于浩等人通過兩步電化學(xué)過程制備了一種經(jīng)鈷氧化納米簇和過氧化聚吡咯復(fù)合物修飾的電極。制備出的電極用電化學(xué)方法和SEM進(jìn)行檢測，結(jié)果表明修飾后的電極有良好的穩(wěn)定性、抗干擾性以及在葡萄糖氧化過程中有很好的電催化

9、效率。圖（4）是制備出的電極檢測后得到的循環(huán)伏安曲線。從實(shí)驗(yàn)圖可以看出，葡萄糖加入之后一個處于0.53v的陽極峰能被觀察到。在CoOx/OPyox/CCE上葡萄糖響應(yīng)的電流值比在CoOx/CCE要高得多。這一點(diǎn)證明出過氧化聚吡咯高分子能改善CoOx的電催化性能。CoO2/CoOOH基團(tuán)催化氧化葡萄糖 的機(jī)制可能是： CoOOH + OH CoO2 + H2O + e ； 圖（4）CoO2+ H2O +glucose CoOOH + OH +gluconolactone 在人的血樣中，維生素C（AA），多巴胺（DA），尿酸（UA）和葡萄糖是共存的，但在正常生理狀態(tài)下葡萄糖含量是前三者的30多倍。

10、圖（5）是在100uM葡萄糖濃度下測定AA，UA和DA對葡萄糖檢測影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)果顯示，10uM的AA,DA和UA分別給出了3.9,2.3,3.1的相對誤差（曲線a所示）；而5uM的AA,DA和UA給出了14.1，8.7和10.2的相對誤差。此外，該小組同樣就麥芽糖和果糖對葡萄糖檢測的影響做了實(shí)驗(yàn)測量，結(jié)果顯示向100uM葡萄糖中加入50uM麥芽糖和100uM果糖之后，不會對葡萄糖的測量產(chǎn)生任何 圖（5） 影響。以上所有結(jié)果表明，修飾后的電極有優(yōu)異的抗干擾能力。這種優(yōu)異的抗干擾能力可能來源于過氧化聚吡咯。在過氧化的過程中，摻雜的離子從聚吡咯分子表面脫離出來，一些含氧的基團(tuán)比如羰基和羧基被引

11、入作為聚吡咯的組成單元，導(dǎo)致高分子帶上負(fù)電荷。在靜電排斥力的作用下，過氧化聚吡咯能夠排斥一些帶負(fù)電的分子，防止與之結(jié)合，實(shí)現(xiàn)一定的抗干擾能力?？偟膩碚f，該小組的工作設(shè)計(jì)制備出了一種新型結(jié)構(gòu)的電極。該電極不僅在穩(wěn)定性和穩(wěn)定性有所提高，同時還具有一定的抗干擾能力以及比較高的催化葡萄糖氧化能力等?；谏鲜鰞?yōu)勢，該電極可以被用于檢測人體血樣中的葡萄糖含量。2.3光子晶體水凝膠可選擇性傳感葡萄糖6最近，在水和空氣的交界面上快速制造2-D CCA（膠體晶體微陣列）已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)。這種自組裝方式能夠在2分鐘內(nèi)生成連續(xù)性的2-CCA單層。同傳統(tǒng)的3-D CCA自組裝相比，這種氣液界面的反應(yīng)方式更加簡單快速。由于

12、2-D CCA很容易合并進(jìn)入水凝膠，所以將2-D CCA與葡萄糖響應(yīng)的水凝膠相結(jié)合，用來提高制造速度和檢測靈敏度。薛飛等人根據(jù)上述理論開發(fā)出基于2-D CCA的可視化葡萄糖傳感。他們將2-D CCA單層和用苯硼酸修飾過的水凝膠結(jié)合，當(dāng)這種復(fù)合結(jié)構(gòu)與葡萄糖發(fā)生響應(yīng)時會使得水凝膠的電位發(fā)生變化，從而誘導(dǎo)相鄰2-D CCA粒子之間的間隔改變，導(dǎo)致德拜衍射的粒徑環(huán)改變，實(shí)現(xiàn)可視化測量。這種傳感器的一個優(yōu)勢在于2-D CCA簡便快捷地合成和利用德拜散射環(huán)作為一種“顯示器”；更重要的是，2-D PC水凝膠在生理離子強(qiáng)度（150mM）的情況下展示 圖（6）出對葡萄糖的高敏感性。（圖（6）為復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備流程

13、） 在室溫和接近生理離子強(qiáng)度的環(huán)境下2-D PC與葡萄糖發(fā)生反應(yīng)，結(jié)果如圖（7）所示。當(dāng)葡萄糖的濃度增加時，水凝膠傳感器會發(fā)生收縮。當(dāng)葡萄糖濃度增加到0.1mM時，2-D粒子間隔從843nm下降至830nm。當(dāng)葡萄糖濃度增加到10mM時，間隔降至775nm?？傊?-D光子晶體水凝膠在整個人體生理的葡萄糖濃度范圍內(nèi)對葡萄糖顯示較高的敏感度。 圖（7） 此外，2-D光子晶體水凝膠傳感器的顏色會從紅色變?yōu)辄S色，隨著葡萄糖濃度的升高逐步轉(zhuǎn)為綠藍(lán)。（a圖所示）當(dāng)可視化檢測0.1mM葡萄糖時，散射光顏色會由紅變?yōu)槌壬?。人體中除了葡萄糖之外還含有豐富的果糖和半乳糖，在檢測葡萄糖時需要排出此類干擾，他們繼續(xù)做

14、了一組對比實(shí)驗(yàn)。從對照實(shí)驗(yàn)反映的結(jié)果來看，果糖和半乳糖會使2-D光子晶體水凝膠膨脹，粒子之間的間隔變大（b圖所示）。膨脹的2-D光子晶體水凝膠仍然會導(dǎo)致散射光顏色的改變，由此也說明了2-D光子晶體水凝膠對葡萄糖檢測具有高靈敏度和特異性，今后有望在活體內(nèi)進(jìn)行檢測。2.4PHPMA(聚羥丙甲丙烯酸甲酯)應(yīng)用的葡萄糖傳感檢測7張立強(qiáng)小組發(fā)明了一種熒光傳感器,用來在單細(xì)胞和多細(xì)胞水平上研究細(xì)胞的代謝。他們用在藥物釋放上廣泛使用的PHPMA作為生物相容性的高分子。這種高分子擁有小部分帶正電的PMAETMA結(jié)構(gòu)，確保其具有細(xì)胞通透性。葡萄糖探針單體是由HPMA和MAETMA異分子聚合而成。為了減少細(xì)胞外復(fù)

15、雜的環(huán)境對檢測精度的影響，Rhod-MA被整合到聚合物傳感器中。傳感器的合成方法使用的是傳統(tǒng)的自由基聚合（如圖（8）所示）在DMF體系中將Rhod-MA，GS-MA，HPMA和MAETMA進(jìn)行異分子聚合。聚合好的 圖（8）葡萄糖傳感器（G-PS）純化過程包括：從DMF溶液中沉淀，再到用丙酮除去未發(fā)生聚合的單體，最后進(jìn)行透析。傳感器與葡萄糖在PBS緩沖液中的反應(yīng)結(jié)果如圖（9）所示。圖A中藍(lán)色的最大發(fā)射波長隨著葡萄糖濃度的增加從445nm逐步變大。同未加葡萄糖相比，加了50nM葡萄糖后在445nm處的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了4.5倍，原因是光誘導(dǎo)了電子轉(zhuǎn)移。來源于羅丹明基團(tuán)且最大值為580nm的橙色發(fā)射波沒

16、有顯示出對葡萄糖的響應(yīng)。這意味著合成的探針分子能夠用于葡萄糖傳感。圖B展示的是熒光強(qiáng)度隨葡萄糖濃度的變化。在10mM以下，傳感器對葡萄糖有相當(dāng)好的靈敏度，尤其是在0.1mM到5mM之間。在0.1mM到1mM之間，傳感器對葡萄糖的響應(yīng)呈線性關(guān)系。正常細(xì)胞胞內(nèi)的葡萄糖濃度可能在 圖（9） 0.1mM到5mM之間，這取決于細(xì)胞的生理狀態(tài)，因此我們可以在線性范圍內(nèi)對細(xì)胞內(nèi)的葡萄糖濃度進(jìn)行監(jiān)測。該小組還就該傳感器對葡萄糖，果糖，半乳糖和甘露糖特異性做了比較。傳感器對其他三種糖均有響應(yīng)，并且對果糖的敏感性最高?？紤]到在細(xì)胞培養(yǎng)過程中除了葡萄糖之外少有其他糖類物質(zhì)的加入，所以該傳感器對果糖的高靈敏性不會對細(xì)

17、胞代謝過程中葡萄糖含量的檢測產(chǎn)生影響?？傊?，以傳感器為基礎(chǔ)的上述聚合物為細(xì)胞內(nèi)葡萄糖濃度的測量提供了一個靈活的平臺，能被擴(kuò)展到其他傳感器應(yīng)用之中。今后對其更深入的研究是在單個活細(xì)胞體內(nèi)實(shí)施葡萄糖的分析檢測。2.5PVPBA（聚4- 乙烯基苯硼酸 ）應(yīng)用于慢性傷口預(yù)測8Fransiska S. H. Krismastuti等將PVPBA-SH聚合物嫁接到多孔硅（pSi）反射膜上。聚合物在生理?xiàng)l件下對葡萄糖的反應(yīng)可以通過用IRS測定EOT的變化和pSiRF的反射率峰值的變化來反映。在檢測過程中，pSi-PVPBA表面暴露在pH為7.4的緩沖液中10分鐘，然后讓處于赫佩斯緩沖液中經(jīng)10倍稀釋的創(chuàng)面積

18、液暴露于表面，稀釋后的創(chuàng)面積液的pH為8.1。表面暴露在緩沖液和創(chuàng)面積液中5個循環(huán)，然后測定EOT的變化，加過10mM葡萄糖的創(chuàng)面積液也需測量。結(jié)果如圖（10）a所示。明顯地，暴露在創(chuàng)面積液之后pSi-PVPBA的EOT值下降了0.14。由于這種特別的創(chuàng)面積液（WF）樣品葡萄糖濃度很 圖（10） 低，故EOT值的變化是由于創(chuàng)面積液pH的略微變化引起的；向創(chuàng)面積液中添加葡萄糖后EOT下降的更加明顯（下降了0.18）。以上結(jié)果說明創(chuàng)面積液的pH應(yīng)該被調(diào)整，以消除其對EOT值的影響。將創(chuàng)面積液的pH調(diào)至生理狀態(tài)（7.4），檢測過程和之前相同，得到的結(jié)果如圖（10）b所示。添加了葡萄糖的創(chuàng)面積液EOT

19、值下降了0.11，原因在于創(chuàng)面積液中添加葡萄糖生成了陰離子硼酸酯；而未添加的僅下降了0.01，這與商業(yè)化尺度標(biāo)準(zhǔn)是一致的。這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明pSi-PVPBA既對創(chuàng)面積液的pH敏感，也能對葡萄糖發(fā)生響應(yīng)。通過調(diào)整pH至生理?xiàng)l件下，可以對創(chuàng)面積液中的葡萄糖進(jìn)行測定。更進(jìn)一步發(fā)展，該傳感平臺能夠在慢性傷口預(yù)測上有所應(yīng)用。因?yàn)槠咸烟堑乃绞锹詡诏熡闹甘拘晕镔|(zhì)。3、 結(jié)語現(xiàn)階段，葡萄糖檢測在原理上的改進(jìn)基本沒有多大的提升空間了，常用于葡萄糖響應(yīng)的分子一是苯硼酸，另一個就是葡萄糖氧化酶。從以上近兩年的最新研究成果來看，基本沒有出現(xiàn)一種新型的分子或材料，能夠與葡萄糖發(fā)生顯著的化學(xué)作用，進(jìn)而被應(yīng)用于葡萄

20、糖檢測。大家所做的工作無非是在苯硼酸或者葡萄糖氧化酶上連接一些功能性的高分子，這樣做的好處在于高分子的引入或是增強(qiáng)電極的穩(wěn)定性，或是提高檢測的靈敏度，或是提升抗干擾能力，諸如此類。從這一點(diǎn)給我的感受是：科研工作不一定要在理論研究上有不斷的創(chuàng)新，更重要的是要把基礎(chǔ)工作做實(shí)，能將理論轉(zhuǎn)換為成果，產(chǎn)生實(shí)際效應(yīng)。雖然現(xiàn)階段對葡萄糖研究不能在理論上有更大的創(chuàng)新和突破，但這也未必不是一件好事。既然已無新原理可求，那大家的研究熱點(diǎn)都會回歸應(yīng)用，結(jié)合實(shí)際，看誰能把葡萄糖的檢測做的更快，更準(zhǔn)和時間更短。這樣的研究工作也正是老百姓或者消費(fèi)者需要看到的，也正是這樣才能推動產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，才能體現(xiàn)出科學(xué)應(yīng)有的應(yīng)用價值。4、 參考文獻(xiàn)1占達(dá)東，黎瑞珍，李開鴻.糖的檢測.J瓊州大學(xué)學(xué)報，2003-10-28,10（5）.2Z.H.Farooqi,W.T.Wu,S.Q.Zhou and M.Siddiq,Macromol,Chem.Phys.,2011,212,1510-1514.3D.Roy and B.S.Sumerlin,ACS Macro Lett.,2012,1,529-532.4K.T.Kim,J.Cornelissen,R.Nolte and J.van Hest,Adv.Mater.,2009,21,2787.5Ha