中性粒細胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運載蛋白臨床應(yīng)用研究進展

1、中性粒細胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運載蛋白臨床應(yīng)用研究進展 中性粒細胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運載蛋白（NGAL）1993年于中性粒細胞內(nèi)的過氧化物酶顆粒中被發(fā)現(xiàn)。生理條件下少量合成于骨髓中性粒細胞的中幼及晚幼階段，炎癥反應(yīng)和惡性腫瘤可誘使其在多組織（如子宮、前列腺、唾液腺、肺、腎、氣道及消化道上皮等）中大量生成。NGAL因其在急、慢性腎臟疾病中的生物學(xué)預(yù)警作用受到重視，近年來，其在心腦血管疾病，糖尿病等領(lǐng)域的研究也逐漸展開，本研究就NGAL的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性及臨床應(yīng)用研究等進展做一綜述。 一、NGAL的結(jié)構(gòu) NGAL的cDNA及全基因序列分別于1994年和1997年被克隆，位于染色體9q34的NGAL為單拷

2、貝基因，其cDNA全長為5869 bp，包括1695 bp的5'端調(diào)控區(qū)、178 bp的3'端非轉(zhuǎn)錄區(qū)及3696 bp的原初轉(zhuǎn)錄區(qū)，后者由7個外顯子和6個內(nèi)含子構(gòu)成。NGAL 5'端可與CTF/CBP、造血轉(zhuǎn)錄因子、GATA-1和NF-KB結(jié)合；而距起始密碼子ATC上游66bp和69 bp處分別有A和G2個轉(zhuǎn)錄起始位點，推測可能參與基因的表達調(diào)控。同源分析提示NGAL與小鼠癌基因24p3 cDNA全序列同源性為71.3%；其在大鼠的同源基因為neu相關(guān)lipocalin（neu-related lipocalin， NRL）。 作為分泌型蛋白，NGAL的相對分子質(zhì)量約為

3、25 000；含198個氨基酸殘基，包括N端由20個氨基酸組成的信號肽序列及其后含178個氨基酸殘基的肽段，等電點為8.40。與脂質(zhì)運載蛋白家族其他成員類似，NGAL蛋白具有一個保守的三級結(jié)構(gòu)，即由8段反平行式-折疊構(gòu)成的-折疊桶結(jié)構(gòu)，其間的連接環(huán)由一個環(huán)和7個典型的-發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)成，第4、5環(huán)上的游離巰基可與基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）前體（pro-MMP-9）以二硫鍵結(jié)合；折疊桶底部內(nèi)側(cè)則由疏水的芳香族和脂肪族氨基酸殘基形成疏水核，結(jié)合并運輸親脂性配體如白三烯B4等；NCAL蛋白N端為310-螺旋封閉，C端則由-螺旋組成，為開放端，可與配體結(jié)合。該蛋白成熟體可以單體、同源二聚體或與MMP

4、-9形成異源二聚體3種形式存在。明確NGAL蛋白的空間結(jié)構(gòu)有助于進一步開展功能研究。 二、NGAL的生物學(xué)特性 生理狀態(tài)下，除中性粒細胞外，NCAL少量表達于多個系統(tǒng)的上皮細胞，包括呼吸系統(tǒng)支氣管上皮單個黏液細胞；消化系統(tǒng)的胃壁細胞、小腸部分潘氏細胞；泌尿生殖系統(tǒng)的腎小管、前列腺上皮細胞、尿道傘部細胞、乳腺上皮細胞；以及免疫系統(tǒng)的胸腺上皮細胞、淋巴結(jié)單個濾泡中心細胞等。但在腦細胞、周圍神經(jīng)細胞、心臟等組織細胞中并無表達。 NGAL蛋白通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用人胞，其-折疊桶結(jié)構(gòu)可結(jié)合并運輸鐵離子，已知NGAL可以單體形式結(jié)合并轉(zhuǎn)運鐵離子出胞，也可以NGAL-鐵復(fù)合物 形式轉(zhuǎn)鐵人胞；NGAL入胞后

5、一方面競爭性抑制細菌的鐵攝取，另一方面與細菌來源趨化物N-甲?；傲帘奖慕Y(jié)合，促進細胞釋放趨化因子、白介素，對炎癥反應(yīng)起負反饋作用，參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)；同時NGAL-鐵離子復(fù)合物可減輕缺血再灌注損傷中的氧化應(yīng)激損傷，保護腎組織；NGAL也能通過穩(wěn)定細胞極性；增強細胞抗凋亡能力，減輕組織損傷，參與腫瘤的發(fā)病及轉(zhuǎn)移；有關(guān)NGAL生物學(xué)功能的具體機制及其與疾病的關(guān)系詳細闡述見下。 三、NGAL的臨床應(yīng)用及機制 1.NGAL與腫瘤性疾?。篘GAL在腫瘤中有明確的組織特異性：其在乳腺癌、結(jié)腸腺癌、卵巢癌等腫瘤中表達上調(diào)；而在胸腺腫瘤、腎癌和前列腺癌則下降。即使在同一腫瘤組織，如肺癌及胰腺癌的不同亞型中

6、NGAL表達也從陰性到強陽性不等。 腫瘤發(fā)?。篘GAL升高可下調(diào)E一鈣黏蛋白表達，引發(fā)腫瘤細胞骨架重組，增強細胞與基質(zhì)之間的黏附，誘導(dǎo)上皮一間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生；而其基因中-152-60區(qū)段的TPA反應(yīng)元件，可誘導(dǎo)人永生化食管上皮細胞SHEE惡變，沉默NGAL基因可使細胞形態(tài)及細胞間連接恢復(fù)，食管上皮細胞惡性消失，提示NGAL可能作為一個癌基因在食管癌的發(fā)生中起重要作用。 腫瘤增殖：NGAL在胚胎期即可發(fā)揮生長因子相關(guān)的作用，促進細胞增殖；給予外源性NGAL蛋白可使甲狀腺癌細胞集落形成能力增強；上調(diào)NGAL蛋白表達可保護腫瘤細胞免受特定凋亡誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的細胞凋亡，增強肺腺癌細胞，白血病及甲狀腺癌細胞的

7、抗凋亡能力；但存胰腺癌細胞中，NGAL的改變與細胞行為無關(guān)；同樣在食道癌細胞中，NGAL基因水平下調(diào)并不影響端粒酶活性。 腫瘤轉(zhuǎn)移：MMP-9通過降解細胞外基質(zhì)促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、浸潤；NGAL與MMP-9以二硫鍵形成復(fù)合物后，通過抵消組織金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）對MMP-9活性的抑制作用，延長MMP的蛋白水解活性，促進其降解細胞基底膜，進而介導(dǎo)腫瘤細胞浸潤、轉(zhuǎn)移；而NGAL通過攝取鐵離子促進細胞增殖也有助于腫瘤細胞生長浸潤；來自不同實驗室的數(shù)據(jù)顯示NGAL水平與乳腺癌、胃癌、直腸癌及食道癌等的侵襲能力、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移能力、癌細胞浸潤深度等高度相關(guān)：但在結(jié)腸癌中呈負相關(guān)。 NCAL參與了

8、腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲，且在其中表現(xiàn)出明確的組織特異性，因此，探討NGAL在腫瘤疾病中的作用有助于理解腫瘤疾病復(fù)雜的發(fā)病機制，并將其轉(zhuǎn)化至應(yīng)用層面。 2001年首次有人指出NGAL可引起消耗綜合征，與腫瘤惡病質(zhì)相關(guān)，隨證據(jù)積累，NGAL已成為惡病質(zhì)患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子，該作用機制的深入研究有助于尋找腫瘤終末期姑息治療的靶點。 2.NGAL與心腦血管 疾?。后w內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，活性氧簇（ROS）刺激后小鼠各臟器及斑塊內(nèi)NGAL水平上調(diào)，并可被抗氧化劑抑制，提示ROS參與動脈粥樣斑塊的形成，NGAL可通過清除ROS保護細胞免受損傷；但血管平滑肌細胞在體外培養(yǎng)時，又可見內(nèi)膜和中膜平滑肌均表達NGAL

9、、MMP-9，后者與血管重塑、動脈粥樣硬化和斑塊破裂有關(guān)，血管損傷后兩者的表達水平同時上調(diào)，推測NGAL/MMP-9復(fù)合物的增加是斑塊不穩(wěn)定的主要原因之一；已知脂肪、肺組織是肥胖狀態(tài)下NGAL升高的主要來源，由此發(fā)現(xiàn)NGAL與肥胖相關(guān)代謝綜合征的一些因素如血脂異常，胰島素抵抗等相關(guān)，后者可誘發(fā)異常脂蛋白血癥，影響血管壁細胞的能量代謝，促進動脈粥樣硬化形成；且NGAL在動脈粥樣硬化斑塊相關(guān)疾病如心肌梗死、急性動脈粥樣硬化性腦血管病中的表達均升高，推論NGAL與動脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但具體機制未明。此外，NGAL在心臟移植中調(diào)節(jié)缺血一再灌注的免疫損傷，有報道指出NGAL還可能參與心臟移植后

10、炎癥的調(diào)節(jié)作用。 NGAL與心血管疾病的關(guān)系研究剛剛起步，爭議頗多，其參與炎癥負調(diào)節(jié)的免疫功能對疾病起保護作用，但隨著炎癥狀態(tài)的持續(xù)，NGAL/MMP-9復(fù)合物表達增加又推動疾病進展，因此其在疾病中的功能及意義期待更多的研究證實。 3.NCAL與呼吸系統(tǒng)疾?。郝宰枞苑尾。–OPD）是一種呈慢性進展并以氣道不完全可逆的氣流受限為特征的肺部疾病，中性粒細胞和肥大細胞釋放的蛋白水解酶MMPs對肺組織的破壞推動了疾病進展，兩項不同的研究顯示：CT確診的肺氣腫患者，其血清及支氣管肺泡灌洗液中NGAL水平顯著升高，推斷NGAL的顯著增高與MMP-9免疫反應(yīng)性增高相關(guān)聯(lián)。氣道高反應(yīng)性疾病中檢測痰及血清N

11、GAL水平上調(diào)，并證實是受循環(huán)血液中NO刺激所致，其機制尚不明確。 4.NGAL與腎臟疾?。篘GAL在腎臟病領(lǐng)域最早被作為急性腎損傷（AKI）新的早期診斷標志物提出，近年來發(fā)現(xiàn)慢性腎臟?。–KD）、繼發(fā)性腎臟病中NGAL同樣具有診斷及預(yù)警意義。 （1）AKI：正常情況下NGAL在腎組織少量表達，缺血.再灌注腎損傷動物模型中血、尿NCAL分別上升300倍和1000倍。針對兒童心臟手術(shù)的研究顯示并發(fā)AKI者術(shù)后2h尿NCAL濃度明顯升高，遠早于1-3 d后才出現(xiàn)改變的血清肌酐，敏感性可達82%，特異性為90%；而術(shù)后12 h尿NGAL水平則與AKI的病死率明顯相關(guān)；成年患者心臟手術(shù)后2h尿NGAL

12、同樣可作為AKI的早期診斷指標，并與其發(fā)病率及體外循環(huán)持續(xù)時間明顯相關(guān)，但該相關(guān)性較兒童低，考慮可能與受試人群基礎(chǔ)疾病狀態(tài)等因素相關(guān)。在腎移植手術(shù)中，尿及腎組織中的NGAL高表達均與術(shù)后腎功能延遲恢復(fù)（DGF）相 關(guān)，尿NCAL每上升100 g/L，DGF風(fēng)險相應(yīng)上升20%；而血清NGAL的改變則有助于判斷患者是否需要透析治療。 注射造影劑后2 h血、尿NGAL診斷AKI發(fā)生的敏感性為73%，特異性為100%，且造影劑劑量與疾病發(fā)生無明顯相關(guān)性。但針對143例全身炎癥反應(yīng)綜合征患者的研究指出，入院24 h血NGAL檢測選取臨界值139 g/L時，判斷AKI的敏感性為86%，特異性僅為39%；不

13、能作為AKI診斷依據(jù)，可能與膿毒癥全身炎癥反應(yīng)而并發(fā)AKI機制不同有關(guān)。 此外，NGAL被指出通過誘導(dǎo)損傷后的近端小管上皮細胞血紅素加氧酶-1（Hemeoxygenase-1，HO-1）及N-鈣黏蛋白高表達，起到保護腎功能的作用，同時參與小管上皮細胞的修復(fù)過程，但因缺乏進一步實驗依據(jù)，尚未能應(yīng)用至臨床。 （2）CKD：腎纖維化是指正常腎組織被細胞外基質(zhì)所取代，伴腎功能進行性不可逆性損害的過程，最終致CKD發(fā)生。越來越多的證據(jù)證實NGAL參與其中：機制涉及NGAL引起Ras誘導(dǎo)的下游信號蛋白磷酸化消失，影響Ras-MAPK通路；MMP-9活性上調(diào)促進腎臟纖維化發(fā)生等方面。而NGAL的反式作用因子

14、cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白活化后可降低上皮細胞的黏附性能，產(chǎn)生同樣結(jié)果。一項針對45例CKD 24期患者的分析研究表明，與傳統(tǒng)的小球損傷標志物胱抑素C相比，進入CKD 3期以上的患者，NGAL與疾病的相關(guān)性更高，且可作為疾病進展的獨立預(yù)測因子。 （3）糖尿病腎?。?007年Wang等發(fā)現(xiàn)，在糖尿病或肥胖小鼠體內(nèi)，NGAL可在脂肪組織、肝臟大量表達，遠高于對照組。同期的臨床驗證顯示，NGAL與肥胖、高脂血癥、高血糖、胰島素抵抗呈正相關(guān)（P0.05），與HDL水平呈負相關(guān)。接受羅格列酮治療后NGAL明顯下降。由此推論NGAL是肥胖及其相關(guān)代謝疾病的炎性標記物，并參與2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程，而現(xiàn)有糖尿病腎病診斷依據(jù)尿微量白蛋白，與之相比，NGAL升高可明顯提前，并與腎功能進展呈正相關(guān)，擬成為2型糖尿病的預(yù)警標志物。 （4）其他：生理狀態(tài)下NGAL經(jīng)腎小球濾過，大部分被近端小管重吸收，尿中基本不可見。因此檢測尿NGAL水平可判斷腎小管重吸收功能，有研究證明在腎病