一種簡便高效利用重疊延伸PCR進(jìn)行基因定點突變的方法

1、3基金項目:中科院知識創(chuàng)新工程,NO.KJCX1-S W -07通訊作者:修瑞娟一種簡便高效利用重疊延伸PCR 進(jìn)行基因定點突變的方法3蘇燕1邵國1高嵩單2于明華2修瑞娟2(1.包頭醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,內(nèi)蒙古包頭014010;2.中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院微循環(huán)研究所摘要目的:建立一種簡便快速的重疊延伸PCR 基因定點突變方法。方法:采用重疊延伸PCR 的方法將人TGF-2基因啟動子區(qū)(-270bp +280bp -114bp 的5C GTG3序列定點突變?yōu)?TTTG3,前兩次PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后無需純化,直接將膠條切下置于EP 管中,-80冷凍10m in

2、,然后將膠條離心后分別取上清液作為模板進(jìn)行第三次PCR,以獲得全長的突變目的基因,最后將此突變基因插入報告載體pG L3-Basic 進(jìn)行基因測序。結(jié)果:人TGF -2基因啟動子區(qū)突變序列的測序結(jié)果與預(yù)期完全一致。結(jié)論:此方法簡便經(jīng)濟(jì)、突變準(zhǔn)確,是一種非常實用的基因定點突變方法。關(guān)鍵詞重疊延伸PCR;基因突變;基因測序A S im ple,Fa st and Eff i c i en t S ite -d i rected M ut agenesisM ethod w ith O ver -exten ti on PCRSU Yan 1,SHAO Guo 1,GAO Songdan 2,Y U

3、 M i n ghua 2,X IU Ru ijuan2(1.D epart m ent of B ioche m istry and M olecular B iology,B aotou M edical College,B aotou 014010,China;2.Institute of M icrocirculation,Peking Union M edical College &Chinese Acade m y of M edical Sciences Abstract Objective:t o intr oduce a si m p le,fast overlap

4、-extensi on PCR site -directed mutagenesis method .Methods:Overlap -extensi on PCR was used t o mutagenate hu man TGF -2gene p r omoter (-270bp +280bp -114bp regi on fr om 5CGTG3t o 5TTTG3.The first t w o PCR p r oducts were electr ophoresised on agar ose -gel,instead of purificati on,the ai m ed se

5、g ments gel were cut down and put int o EP at -80f or 10-20m in cool,then the gel were centrifuged and the supernatants were used as te mp late for the third PCR.The final PCR seg ment was cl oned int o pG L3-basic for sequencing .Results:hua man TGF -2gene p r omoter mutant had been successfully co

6、nstructed .Conclusi on:The method was effective and si m p le for site -directed mutagenesis constructi on .Key words Overlap -extenti on PCR;Mutagenesis;Gene sequencing隨著分子生物學(xué)研究的突飛猛進(jìn),基因定點突變技術(shù)成為一項重要的分子生物學(xué)實驗技術(shù)手段,在基因表達(dá)及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能之間關(guān)系等方面的研究中得到廣泛的應(yīng)用。常用的定點突變方法主要有寡核苷酸引物介導(dǎo)的定點突變、PCR 介導(dǎo)的定點突變及盒式突變。目前,PCR 介導(dǎo)的定點

7、突變技術(shù)是使用最普遍的定點突變方法,以PCR 為基礎(chǔ)的突變方法一般有大引物突變、重疊延伸突變及一步快速突變。重疊延伸突變PCR 可以在DNA 區(qū)段的任何位置突變,且可以在側(cè)引物的兩端設(shè)計酶切位點,方便進(jìn)一步的連接克隆1-2。本研究對傳統(tǒng)重疊延伸PCR 法進(jìn)行定點突變的實驗方法進(jìn)行了改進(jìn),進(jìn)一步節(jié)約了實驗成本,縮短了實驗周期,是一種簡便、經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確的基因定點突變方法。1材料與方法1.1材料Pyr obest TaqDNA Poly merase 、dNTP 、T4DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶M lu 和Bgl 及瓊脂糖購自大連寶生物工程有限公司,凝膠回收和質(zhì)粒提取試劑盒購自北京鼎國生物技術(shù)

8、有限責(zé)任公司,報告載體pG L3-Basic 購自Pr omega 公司。引物(引物1:5GT ATCAACGCGT AAAACGGG AG ACTTG ATTGT3,引物2:5G AT CT AAG ATCT ATTGCTCGCTT AGGGT AGG3,引物3:5ACCAAAAGCTCT CCCCG AAC3,引物4:5GGG AG AGCTTTTGGT CT AAGT A3由上海生物工程有限責(zé)任公司合成,其他試劑均為進(jìn)口分裝。1.2方法9552007年第23卷第6期Vol 123No 162007包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報J O URNAL O F BAO T O U M E D I CAL COL

9、L EGE子區(qū)報告基因的構(gòu)建首先利用引物1、引物2從人血DNA中擴(kuò)增人TGF-2基因啟動子區(qū)-270bp +280bp的基因區(qū)段,然后將此PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收,回收片段與載體pG L3-Basic分別經(jīng)M lu和Bgl 雙酶切后進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5,經(jīng)克隆培養(yǎng)后挑取陽性菌落進(jìn)行培養(yǎng),提取質(zhì)粒后送公司測序。2結(jié)果2.1重疊延伸PCR擴(kuò)增人TGF-2基因啟動子區(qū)-114bp區(qū)突變基因和分別為5端帶有突變位點的短片段PCR產(chǎn)物,是以和為模板進(jìn)行延伸并擴(kuò)增得到的帶有突變位點的564bpPCR產(chǎn)物,見圖1。2.2突變基因的測序質(zhì)粒測序結(jié)果顯示,人TGF-2基因啟動子區(qū)-114位的5C

10、GTG3序列成功突變?yōu)?TTTG3,見圖2。3討論經(jīng)典重疊延伸PCR技術(shù)必需在特定的待突變位點和上下游分別設(shè)計引物,1、3為上下游引物,2、4為突變引物(且2、4的5端部分互補,先以引物1、3在一定條件下進(jìn)行PCR,得產(chǎn)物,再以引物2、4進(jìn)行PCR得產(chǎn)物,將產(chǎn)物和分別純化回收后,將和混合作為模板,以1、4為引物進(jìn)行PCR, 即可圖1重疊延伸法進(jìn)行人TGF-2基因啟動子區(qū)突變M為100bp ladder;為引物1、3擴(kuò)增產(chǎn)物;為引物2、4擴(kuò)增產(chǎn)物;為以產(chǎn)物 和為模板,引物1、2擴(kuò)增得到的突變目的片段圖2人TGF-2基因啟動子區(qū)的基因測序圖譜A:人TGF-2基因啟動子區(qū)-114位的5CGTG3序列

11、;B:突變型人TGF-2基因啟動子區(qū)-114位的5TTTG3序列得到帶突變位點的DNA片段。將其裝入特定的載體中,轉(zhuǎn)化入相應(yīng)的宿主菌,擴(kuò)增后經(jīng)鑒定得到了帶有突變位點的目的DNA3-4。本實驗對經(jīng)典的重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn),采用瓊脂糖凝膠條凍融的方法取代了對產(chǎn)物和的純化回收,用含有目的片段的凝膠條凍出液作為第三次PCR的模板進(jìn)行突變片段的擴(kuò)增,不僅節(jié)約了實驗成本,縮短了實驗周期,而且取得了很好的實驗效果,是一種非常簡便、快速、實用的實驗方法。參考文獻(xiàn)1U rban A,Neukirchen S,Jaeger KE.A rap id and efficientmethod f or site-directed mutagenesis using one-step over2lap extensi on PCRJ.Nucleic Acids Res,1997,25(11:2227-2228.2孫夢寧,薛小平,尹文,等.運用重疊PCR技術(shù)構(gòu)建HCV全長c DNA細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)性突變體J.生物技術(shù)通訊,2006,17(1:27-30.3Ho S N,Hunt HD,Hort on R M,et al.Site-direc