不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白對人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響 - 圖文-

1、·論著·不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白對人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響吳麗丹,馮勝軍,卓華欽,張莞靈,劉華鋒作者單位:523326廣東省東莞市,南方醫(yī)科大學(xué)附屬東莞市石龍人民醫(yī)院腎內(nèi)科(吳麗丹,卓華欽,張莞靈;廣東醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室(馮勝軍;廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎病研究所(劉華鋒【摘要】 目的 探討不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白對人腎小管上皮細(xì)胞(hrTESc 凋亡的影響。方法提取人類微小病變腎病綜合征、膜性腎病綜合征、局灶-節(jié)段性腎病綜合征患者尿蛋白,進(jìn)行蛋白成分分析、細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)、蛋白溶液的肌酐水平等質(zhì)量鑒定后,試驗(yàn)組分別按1、2、4、8g /L 尿蛋

2、白濃度刺激hrTECs 48h ,空白組無尿蛋白,Hoechst 33258染色法觀察hrTECs 凋亡情況。結(jié)果 尿蛋白組分構(gòu)成:微小病變腎病綜合征清蛋白83.8、轉(zhuǎn)鐵蛋白11.9、IgG 3.4;膜性腎病綜合征清蛋白56.4、轉(zhuǎn)鐵蛋白34.6、IgG 6.9;局灶-節(jié)段性腎病綜合征清蛋白59.9、轉(zhuǎn)鐵蛋白15.3、IgG 13.8。尿蛋白濃度1、2、4、8g /L 時(shí),膜性腎病綜合征組較微小病變腎病綜合征組細(xì)胞凋亡率均升高(P 0.05吳麗丹,馮勝軍,卓華欽,等.不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白對人腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響J .中國Effects of Proteinuria on Apo

3、ptosis of Human Renal Tubular Epithelial Cells in Patients with Different Pathological Types of Renal Syndrome WU Li -dan ,FENG Sheng -jun ,ZHUO Hua -qin ,et al.Department of Nephrology ,Southern Medical University Affiliated Dongguan Shilong People's Hospital ,Dongguan 523326,China【Abstract 】 O

4、bjective To explore the effects of proteinuria on the apoptosis of human renal interstitial cells in patientswith different pathological types of renal syndrome.Methods Urinary protein was extracted from patients with minimal change disease (MCD ,membranous nephropathy (MN and focal -segmental renal

5、 synthesis (FSGS .The protein composition a-nalysis ,bacterial endotoxin test and protein creatinine level test were conducted.The urinary protein with concentration of 1,2,4and 8g /L respectively were used to stimulate human renal tubular epithelial cells (hrTECs for 48h ,and the control groupbe th

6、e most crucial pathogenic factor.【Key words 】 Proteinuria ;Nephrotic syndrone ;Apoptosis ;Epithelial cells許多研究證實(shí)尿蛋白在慢性腎臟疾病的進(jìn)展中發(fā)揮了非常重要的作用。尿蛋白的主要作用是能夠活化腎小管上皮細(xì)胞(renal tubular epithelial cell,rTEC,使其分泌各種生物活性因子,在腎間質(zhì)中激活成纖維細(xì)胞和趨化炎性細(xì)胞,參與腎間質(zhì)纖維化。而腎間質(zhì)纖維化是多種腎臟疾病發(fā)展到終末期的共同途徑。腎間質(zhì)纖維化與細(xì)胞增殖、凋亡的動態(tài)平衡密切相關(guān)1-2。但是,尿蛋白的性質(zhì)(清蛋

7、白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG、40100kD血清蛋白等和嚴(yán)重程度在腎小管間質(zhì)病變進(jìn)展中的作用仍有很大分歧。此外,不論是體外還是動物模型中,總是存在一些問題,如大多數(shù)研究僅使用一種或兩種蛋白,或者使用正常血清清蛋白而非患者的血清蛋白對腎小管細(xì)胞損傷進(jìn)行研究。此外,不同病理類型腎病綜合征患者的尿蛋白能否直接導(dǎo)致rTEC凋亡及其差異性,尚無肯定報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)選取臨床上常見的人類不同腎病綜合征患者(微小病變腎病綜合征、膜性腎病綜合征、局灶-節(jié)段性腎病綜合征的完整尿蛋白刺激人腎小管來源的rTEC,分析其凋亡情況,旨在為尿蛋白對人腎小管-間質(zhì)纖維化的機(jī)制提供重要依據(jù),為延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展尋找治療新途徑。1

8、材料與方法1.2 細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出冷凍hrTECs,3740水中快速復(fù)溶,加適量含10胎牛血清的DMEM/ F12培養(yǎng)液(含0.03L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100g/ml鏈霉素,置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)條件為37、5CO2。0.125胰蛋白酶(Trysin-0.02乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2消化傳代。1.3 尿蛋白的提取與質(zhì)量分析選取廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科已經(jīng)臨床確診的原發(fā)性腎病綜合征患者(微小病變腎病綜合征、膜性腎病綜合征、局灶-節(jié)段性腎病綜合征的尿蛋白,且無感染并發(fā)癥,尚未應(yīng)用激素及任何免疫抑制劑,腎活檢病理類型分別為微小病變、膜性腎病和局灶-節(jié)段性腎病綜合征。收

9、集入選患者清潔中、后段尿,冷凍離心,飽和硫酸銨沉淀尿蛋白。PEG20000濃縮。超濾滅菌。蛋白濃度定量。-70保存?zhèn)溆?。挑取一小部分蛋白溶液行蛋白質(zhì)量驗(yàn)證。蛋白電泳:做該標(biāo)本來源尿液的蛋白電泳,旨在排除尿蛋白在提取過程中是否發(fā)生成分變化;細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn):旨在確保蛋白沒受細(xì)菌污染;蛋白溶液的肌酐水平:旨在看蛋白是否還混有尿液。1.4 Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞凋亡hrTECs培養(yǎng)于6孔板中,載玻片爬片,無血清細(xì)胞培養(yǎng)液孵育24 h,使細(xì)胞同步于靜止期,棄上清液,加含尿蛋白培養(yǎng)液,每種病理類型尿蛋白濃度分別為0、1、2、4、8g/ L,孵育細(xì)胞48h;3:1的甲醇:冰醋酸液4固定5 m

10、in,5mg/L的Hoechst33258避光染色5min。選用340 nm的激發(fā)光觀察:在熒光顯微鏡下,活細(xì)胞呈彌散均勻熒光,凋亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒塊狀熒光。如果見到3個(gè)或3個(gè)以上的DNA熒光碎片被認(rèn)為是凋亡細(xì)胞。計(jì)算每孔5個(gè)高倍(400視野平均細(xì)胞總數(shù)、凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞凋亡百分率。空白組設(shè)置為無尿蛋白的培養(yǎng)液刺激hrTECs。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以(xs表示,多組比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA,兩兩比較用方差齊性檢驗(yàn)(levene檢驗(yàn),當(dāng)總體方差齊時(shí),選擇Bonferroni 法;當(dāng)方差不齊時(shí),選擇Tamh

11、ane's T2法。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 細(xì)胞形態(tài)和表面結(jié)構(gòu)相差顯微鏡下可見正常的hrTECs為多角形鵝卵石樣排列,胞體扁平,細(xì)胞緊密銜接,融合成單層(見圖1 。圖1 正常DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)的hrTECs(200Figure1 hrTECs cultured on normal DMEM/F12medium 2.2 抽提尿蛋白的質(zhì)量及分析結(jié)果每種病理類型選擇3例患者,分別抽提出患者的尿蛋白,蛋白溶液的肌酐水平為0.381mol/L,均低于人體參考范圍的下限(參考范圍44133mol/L,鱟實(shí)驗(yàn)確定細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)檢測值為0.008EU/ml,亦低于人體參

12、考范圍的下限(0.1EU/ml。尿蛋白電泳示各病理類型腎病綜合征患者尿蛋白成分相同,主要為清蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG。微小病變腎病綜合征清蛋白83.8、轉(zhuǎn)鐵蛋白11.9、IgG3.4;膜性腎病綜合征清蛋白56.4、轉(zhuǎn)鐵蛋白34.6、IgG6.9;局灶-節(jié)段性腎病綜合征清蛋白59.9、轉(zhuǎn)鐵蛋白15.3、IgG13.8(見圖2 。圖2 不同病理類型腎病綜合征患者尿蛋白的電泳分析Figure2 Electrophoretic analysis of urine proteins from patients with three types of nephrotic syndrome2.3 腎病綜合征患

13、者尿蛋白對細(xì)胞凋亡的影響尿蛋白濃度1、2、4、8g/L時(shí),膜性腎病綜合征組較微小病變腎病綜合征組細(xì)胞凋亡率均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05;局灶-節(jié)段性腎病綜合征組較膜性腎病綜合征組和微小病變腎病綜合征組細(xì)胞凋亡率均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05。3組尿蛋白濃度1、2、4、8g/L時(shí)較空白時(shí),2、4、8g/L時(shí)較1g/L時(shí),4、8g/ L時(shí)較2g/L時(shí),8g/L時(shí)較4g/L時(shí)細(xì)胞凋亡率均升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,見表1。3 討論腎功能的進(jìn)展主要取決于腎間質(zhì)損傷的嚴(yán)重程度。研究表明,尿蛋白可作為獨(dú)立的致病因子,直接造成腎小管間質(zhì)損害3-4。對多種人類和動物模型研究提示尿蛋白是參

14、與損傷和加速腎功能惡化的重要因素5。其中,rTEC增殖凋亡參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生,推測rTEC的過度凋亡可能是腎小管萎縮的原因,并參與了腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制。在多種腎臟疾病的動物模型(如單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型、5/6腎切除模型、高血壓腎硬化模型、慢性環(huán)孢霉素腎病模型、嘌呤霉素氨基核苷慢性腎病模型等6-8以及人體多種腎臟疾病病理標(biāo)本中發(fā)現(xiàn),間質(zhì)纖維化越重的地方,rTEC凋亡數(shù)量越多,間質(zhì)纖維化程度與細(xì)胞凋亡數(shù)量呈正相關(guān)9。但是,成分復(fù)雜的尿蛋白中哪種蛋白成分在疾病的發(fā)展過程中具有致病作用,迄今尚無定論。許多研究表明清蛋白導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷。該機(jī)制包括上皮細(xì)胞-成肌纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化,細(xì)胞因子以及炎

15、性因子單核細(xì)胞趨化蛋白1(MCP-1、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-等的分泌、細(xì)胞外基質(zhì)(ECM的聚積、平滑肌蛋白SM22-表達(dá)等10-13。不過這些研究使用了大劑量的純化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白,或許無法真實(shí)模擬尿中清蛋白的作用。另外許多研究表明某些尿蛋白也許不是腎小管間質(zhì)損傷的始動因素。Morais等14發(fā)現(xiàn)低分子量蛋白不會影響hrTECs的凋亡,而高分子量蛋白則影響hrTECs的凋亡。并且轉(zhuǎn)鐵蛋白也可以通過hrTECs上調(diào)C3的合成,而不是清蛋白15。因此,真實(shí)地分析腎病患者的尿蛋白成分、比例以及與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系,有助于進(jìn)一步了解腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)首先采集尿蛋白,并進(jìn)

16、行質(zhì)量分析(尿蛋白內(nèi)的細(xì)菌內(nèi)毒素對細(xì)胞凋亡帶來毒性已經(jīng)排除,肌酐檢測可以排除尿液成分殘留,提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性;為了更加明確在腎間質(zhì)損傷中尿蛋白的主要毒性成分,因此對尿蛋白的組分差異性進(jìn)行分析,通過蛋白電泳提示不同病理類型腎病綜合征患者的尿蛋白成分相同,主要為清蛋白(大部分、轉(zhuǎn)鐵蛋白、IgG。其中,微小病變腎病綜合征清蛋白83.8、轉(zhuǎn)鐵蛋白11.9、IgG 3.4;膜性腎病綜合征清蛋白56.4、轉(zhuǎn)鐵蛋白34.6、IgG6.9;局灶-節(jié)段性腎病綜合征清蛋白59.9、轉(zhuǎn)鐵蛋白15.3、IgG13.8。采用體外實(shí)驗(yàn),表1 不同病理類型腎病綜合征細(xì)胞凋亡率比較(xs,n3Table1 Compari

17、son of apoptosis rate of hrTECs among different pathological types of nephrotic syndrome組別尿蛋白濃度(g/L空白 1 2 4 8 F值P值注:與微小病變腎病綜合征組比較,*P0.05;與膜性腎病綜合征組比較,P0.05;與尿蛋白濃度空白比較,P0.05;與尿蛋白濃度1 g/L比較,P0.05;與尿蛋白濃度2g/L比較,P0.05;與尿蛋白濃度4g/L比較,P0.05選取人近端hrTECs株,采用上述人類不同病理類型腎病綜合征患者的完整尿蛋白刺激hrTECs,發(fā)現(xiàn)同一病理來源的尿蛋白的濃度與hrTECs凋亡

18、增加存在劑量依賴關(guān)系,即細(xì)胞凋亡數(shù)量愈多,由于該類蛋白組合源于患者自身的蛋白,尤其是其中的清蛋白占了大多數(shù),導(dǎo)致hrTECs的凋亡或許與該類蛋白相關(guān),也旁證了大劑量的純化人血清清蛋白或者牛血清清蛋白導(dǎo)致的腎小管間質(zhì)損傷。此外,局灶-節(jié)段性腎病綜合征患者的尿蛋白作用最強(qiáng),膜性腎病綜合征次之,微小病變腎病綜合征最弱,根據(jù)3類病理類型的尿蛋白的組成可以發(fā)現(xiàn), IgG的組分含量由多至少分別為局灶-節(jié)段性腎病綜合征、膜性腎病綜合征、微小病變腎病綜合征。Bazzi 等16-17研究證實(shí)局灶-節(jié)段性腎病綜合征患者尿IgG 占總蛋白的比例與節(jié)段性腎小球硬化有相關(guān)性。由此,可以推測,尿中存在的IgG可能是尿蛋白

19、對腎小管毒性作用的重要因素,尿IgG的排出可能是腎病進(jìn)展的標(biāo)志之一。由此,可能提示在尿蛋白引起的腎臟纖維化進(jìn)展中,尿清蛋白可能不是最重要的毒性成分。尿蛋白其他成分如脂蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和補(bǔ)體與腎小管間質(zhì)損害的關(guān)系有待下一步的有關(guān)研究證實(shí)。眾所周知,細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡過程,是機(jī)體清除非機(jī)體所需細(xì)胞、維持自身細(xì)胞穩(wěn)定性的一種特殊的細(xì)胞死亡方式,也是清除異常增殖細(xì)胞的一種重要途徑。以上分析表明,hrTECs的異常凋亡與尿蛋白存在必然關(guān)系,尤其是尿中IgG成分的存在和含量的多少,與hrTECs的凋亡具有重要的因果關(guān)系和劑量關(guān)系,大量腎小管細(xì)胞凋亡,使腎小管局部環(huán)境破壞,這可能是觸發(fā)間質(zhì)細(xì)胞過度增

20、殖,并最終形成纖維化的重要因素。本研究結(jié)果可能為深入闡明腎間質(zhì)纖維化提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù),最終將為延緩慢性腎衰竭的進(jìn)展尋找治療新途徑。參考文獻(xiàn)1 劉華鋒,姚翠微,皇甫長梅,等.白細(xì)胞介素18對促進(jìn)腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化的影響J.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2004,5(12:690-693.2 黃凌虹,張國強(qiáng),葉任高,等.細(xì)胞增殖與凋亡在單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化發(fā)病中的意義J.中華腎臟病雜志,2000, 16(1:24-27.3 Keane WF.Proteinuria:its clinical importance and role in progressive re-nal disease

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