新城疫病毒HN蛋白的抑瘤機制及其研究進展.docx

1、第2】卷第3期2014年9月天津農(nóng)學院學報JournalofTianjinAgriculturalUniversityVbl.21,No.3September,2014文章編號：1008-5394(2014)03-0049-04新城疫病毒HN蛋白的抑瘤機制及其研究誑展高靜2,董東曉】，龍雨清'，李萌'，李留安'，金天明15奢(1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津300384：2.天津生機集團股份有限公司，天津300384)摘要：新城疫病毒囊膜上較大的纖突樣糖蛋白由新城疫病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)基因編碼。HN蛋白即血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白，它不僅介導病毒吸附于腫

2、瘤細胞，而且與融合阪白一起幫助病毒侵入腫瘤細胞,其神經(jīng)氨酸酶活性能水解宿主細胞表面的唾液酸，暴露宿主細胞的生物識別位點。它還能夠水解病毒粒子表面糖鏈末端的唾液酸，防止病毒粒子在宿主表面簇集，并旦能夠引入新的粘附因子和免疫原性分子，誘導機體免疫系統(tǒng)識別。關(guān)鍵詞：新城疫病毒；HN蛋白；抑瘤機制中圖分類號：S857.4文獻標識碼：AAntitumorMechanismofNewcastleDiseaseVirusHNProteinandItsResearchProgressGAOJing1,2,DONGDong-xiao1,LONGYu-qing1,LIMeng1,LILiu-an1,JINTian

3、-ming1'頃心卬就灑小。(1.CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China;2.TianjinShengjiGroupLimitedCompany,Tianjin300384,China)Abstract:Thelargespike-likemembraneglycoproteinsfromtheNewcastlediseasevirusenvelopewereencodedbyNewcastlediseasevirushemagglutin

4、in-neuraminidase(HN)gene.HNproteinistheabbreviatedformofhemagglutinin-neuraminidaseprotein,itnotonlymediatesvirusadsorptionontumorcells,butalsomakesvirusinvadetumorcellswiththehelpofthefusionprotein,anditsneuraminidaseactivitycanhydrolyzesurfacesialicacidofthehostcellsandexposethebiologicalrecogniti

5、onsitesofhostcells.Itisalsoabletohydrolyzesialicacidlyingonsugarchainendofvirusparticlesurface,preventvirusparticlesfromclusteringonthehostsurface,furthermore,itcanintroducenewimmunogenicfactorsandadhesionmoleculestoinducetherecognitionofimmunesystems.Keywords:Newcastlediseasevirus;HNprotein;antitum

6、ormechanism收稿日期：2013-10-18基金項目：國家白然基金項目,TRAIL和H、基因重組腺病毒的構(gòu)建及其對禽白血病腫瘤細胞的抑制作用”(31072109);天津市高等學?？萍及l(fā)展基金項目“APPlS影載體豬巴氏桿弟基因疫苗的研究°(20060720);天津市自然科學基金重點項目“Ad-TRAIL-2A-HN的構(gòu)建及其對MD腫瘤細胞的抑制作用”(12JCZDJC22100)作者簡介：高伸(1982-),女，天津市人，工程師，碩士，研究方向為中獸藥新藥研發(fā)及獸醫(yī)生物技術(shù)與疫苗。E-mail：gj090329。通信作者：金天明(1968-),男,內(nèi)蒙古通江人，教授，博上，主

7、要研究方向為分子免疫病理學。E-mail：。自1990年人類首次進行疾病的基因治療試驗以來，基因療法作為一種全新的治療手段日益引起人們的重視，特別是對現(xiàn)在還不能使用傳統(tǒng)醫(yī)療手段徹底治愈的惡性腫瘤，基因治療已成為該領(lǐng)域的研究熱點和發(fā)展趨勢，其核心策略之一是通過基因重組等手段將目的DNA轉(zhuǎn)染入患者的腫瘤細胞，誘導腫瘤細胞凋亡，從而達到治療疾病的目的。因此，選擇能高效、特異地增強腫瘤細胞凋亡作用的目的基因成為該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵和難點。口前，新城疫病毒的抗腫瘤作用逐步為人們所重視并已轉(zhuǎn)入臨床研究階段，有分析表明，通過HN蛋白的篩選能夠引起抗原變異，并且能控制當前流行的新城疫閔。1 NDV的結(jié)構(gòu)特性NDV

8、是一種有囊膜、單鏈、不分節(jié)段的負鏈RNA病毒，在分類上屬于副黏病毒科(paramyxoviridae)的副黏病毒亞科(paramyxovirinae)中的腮腺炎病毒屬(rubulavirus),可感染禽類引起新城疫氣NDV的基因組包括6種基因，分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白，據(jù)分布位置不同可分為內(nèi)部蛋白和外部蛋白。內(nèi)部蛋白包括核衣殼蛋白（nucleocapsid,NP）、磷酸化蛋白（phosphateprotein,P）、高分子質(zhì)量RNA聚合前（largeprotein,L）;外部蛋白包括融合蛋白（fusionprotein,F）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白及基質(zhì)蛋白（matrix,M）oNP、P及L蛋白在

9、功能上相互促進，共同參與病毒RNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。其中，覆蓋在病毒囊膜表面的血凝素和神經(jīng)氨酸酶（HN）活性的糖蛋白、融合糖蛋白（F）以及脂膜內(nèi)的非糖基化內(nèi)膜蛋白（M）與病毒的脂質(zhì)膜有關(guān)，即HN和F蛋白為糖基化蛋白，構(gòu)成NDV的纖突，是NDV重要的免疫原成分。M蛋白為囊膜內(nèi)表面支撐物，與F蛋白具有協(xié)同作用，共同形成具有感染性的病毒粒子。另外3種蛋白，即核衣殼蛋白（NP）、磷蛋白（P）和高分子質(zhì)量蛋白（L）與基因組RNA有關(guān)HN蛋白的結(jié)構(gòu)與功能NDV中HN基因是構(gòu)成NDV囊膜上較大的纖突樣糖蛋白的主要編碼基因，其基因長1734bP,編碼577個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量約63kD,兼有血凝素（HA）和神經(jīng)

10、敏酸酶（NA）雙重活性。其中，HA負責識別易感細胞的唾液酸受體并進行吸附，實現(xiàn)病毒感染細胞的第一步過程。NA則水解.宿主細胞表面的唾液酸，分解并破壞受體，暴露宿主細胞的生物識別位點，促進新生病毒粒子從感染細胞膜上釋放，同時，其還具有活化巨噬細胞、自然殺傷細胞、穩(wěn)定活化的】'細胞的作用氣受體的識別取決于NA活性，但調(diào)節(jié)NA活性的HN殘基在促進病毒吸附作用方面并非不可或缺，也就是說,NA活性發(fā)揮還需要其他HN蛋白的介導才能與受體結(jié)合。此外，HN蛋白還可直接作用于受體位點，并具有促進F蛋白融合作用的啟動功能，HN蛋白通過去除新合成病毒核衣殼蛋白上的唾液酸，對子代病毒粒子進行加工，使F蛋白充分

11、接近細胞，完成病毒與細胞膜的融合。有研究結(jié)果表明，嵌合體位FM（l+2）,包含SV41融合衍生結(jié)構(gòu)域Ml利1M2,共表達SV41HN蛋白介導的細胞間融合，表明這些結(jié)構(gòu)域參與決定HN蛋白的特異性?，F(xiàn)12確定，HN蛋白中的E401、R416和Y526位氨基酸殘基對細胞與受體結(jié)合以及促進融合發(fā)揮著重要作用。應(yīng)用單克隆抗體技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，HN蛋白的主要疏水區(qū)在N末端，即N末端是與病毒外膜的連接部位。在由75個鉗:基酸殘基構(gòu)成的N末端中，第126位氨基酸殘基為胞質(zhì)內(nèi)區(qū)（尾部）,第27-160（*氨基酸殘基為跨膜區(qū)（桿狀部）,其余氨基酸殘基為胞質(zhì)外氨基酸（球形頭部）o相對來說，各毒株HN蛋白的氨基酸差異主要

12、集中在N末端第175位，自第76位氨基酸起至C端的整個膜外區(qū)，氨基酸差異較小?？缒^(qū)和膜內(nèi)區(qū)均參與HN四聚體結(jié)構(gòu)的形成，當二者缺失時，HN蛋白只能形成二聚體結(jié)構(gòu)叫HN蛋白中HA與NA兩個抗原位點是相互獨立的，即HA活性位點靠近HN蛋白C末端，NA活性位點位于HN蛋白中心。但在一級結(jié)構(gòu)中，其第193201位基基酸殘基同時參與了這兩種結(jié)構(gòu)的形成，因此，這兩個活性位點町能存在某種程度的折疊氣HN亞單位間通過二硫鍵形成二聚體，兩個二聚體以非共價鍵形成四聚體,故成熟的HN為四聚體寡聚蛋白。對于強毒株NDV-AV而言，每個同型二聚體的亞單位都是通過球形結(jié)構(gòu)域中第123位半胱忽酸（Cys）的二硫鍵相連接，其

13、中球形頭部由多個0片狀結(jié)構(gòu)域構(gòu)成,第175228位、第237287位、第316396位、第401443位、第472515位和第520571位氨基酸分別為81、82、63、64、85和86（圖1）。球形頭部含有NA活性位點、受體識別位點和已知的所有抗原位點氣HN蛋白含有6個潛在的糖基化位點，其中4個（119、341、433、481位氨基酸）保守性強，2個（508和538位氨基酸）保守性較差。糖基化作用不參與HN蛋白的轉(zhuǎn)運，但對NA活性的形成是必需的。新城疫病毒融合蛋白特異性序列對胞外構(gòu)象的活化、蛋白間的相互作用極其重要同。上述研究表明，HN蛋白在抗腫瘤方面不但介導了病毒吸附腫瘤細胞的過程，同時還

14、與融合蛋白一起協(xié)助病毒侵入細胞。4014U449498GAEGARRfUCNTTV$47NDVHN1741761瞬401416449498$26MPSDNKKSCSGAEGARRfUCNTTVY_C%瀏誦J5S圖1HN蛋白的球形結(jié)構(gòu)域和6個0片狀結(jié)構(gòu)域2 HN蛋白的抑瘤活性及其機制自從發(fā)現(xiàn)NDV能夠抑制腫瘤細胞以來，HN蛋白的抗腫瘤作用就一直受到研究者的重視。已進行的I期臨床試驗顯示，HN蛋白對惡性黑色素瘤和一些消化系統(tǒng)惡性腫瘤具有良好的治療效果。通過靜脈注射，HN蛋白可選擇性殺傷多種腫瘤細胞,卻對正常細胞無明顯的毒副作用氣隨著NDV抗腫瘤機制研究的不斷深入，HN蛋白在NDV抗腫瘤過程中發(fā)揮的

15、作用日益受到關(guān)注。HN蛋白抗腫瘤的機制主要表現(xiàn)在以下幾方面。3.1去除腫瘤細胞表面唾液酸，促進T細胞識別細胞發(fā)生突變或癌變后，存在許多導致腫瘤細胞逃避免疫監(jiān)視的機制。其中，唾液酸(sialicacid,SA)遮蔽是主要原因之一。SA位于細胞表面，它既有掩蓋細胞膜、阻止細胞被識別的功能,同時其自身又能形成特殊的識別位點，從而遮蓋細胞表面抗原，導致機體免疫細胞無法正確識別”氣因此，不能發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷作用。SA作為細胞膜糖蛋白的重要組分，在機體組織和體液中廣泛分布，參與細胞的識別、黏附和接觸抑制等過程。SA已成為臨床上一種廣j普腫瘤標志物，可通過對血清中SA濃度的測定，將其作為診斷腫瘤的輔助指

16、標和療效觀察指標。臨床檢測結(jié)果顯示，腫瘤細胞表面SA的含量明顯高于正常細胞，細胞表面抗原因受到SA的遮蔽而無法被免疫細胞識別，因此，使腫瘤細胞逃避免疫防御而得以擴散。HN蛋白通過HA位點與腫瘤細胞表面SA結(jié)合后，在NA的作用下,SA從腫痛細胞表面脫落,導致細胞表面負電荷減少，細胞間排斥力降低，這更利于腫瘤細胞與淋巴細胞的接觸和抗原信息的傳遞。由于SA的脫落，使原本被遮蔽的腫瘤抗原也得到充分暴露，導致腫瘤細胞免疫原性隨之增強。以禽痘病毒為載體，將HN基因?qū)隑16腫瘤細胞實現(xiàn)了HN蛋白在細胞膜上的表達，且B16細胞表面的SA含量顯著降低，表明單純表達HN蛋白也可獲得HA識別、結(jié)合SA受體以及NA

17、降解SA活性的效應(yīng)“°'。3.2HN增強腫瘤細胞表面的粘附性腫瘤細胞因缺乏黏附分子和共刺激分子而難以誘導產(chǎn)生特異性CTL反應(yīng)。HN能在腫瘤細胞表面產(chǎn)生類似于抗原細胞表面的黏附分子和共剌激分子，即在增強淋巴細胞黏附力的同時，還可刺激淋巴細胞分化，激活淋巴細胞有研究報道，經(jīng)HNcDNA修飾的腫瘤細胞制備的瘤苗，可增強抗原遞呈細胞的活性，誘發(fā)動物及病人產(chǎn)生全身性的抗腫瘤免疫應(yīng)答，NDV誘導腫瘤特異性CTL反應(yīng)的主要途徑是通過HN分子的細胞黏附和血凝活性實現(xiàn)的，同時還證明NDV的抗腫瘤作用與NDV顆粒表面HN的活性有關(guān)向。有研究表明，新城疫病毒的F蛋白和HN蛋白在感染過程中發(fā)揮著關(guān)鍵

18、性作用，NDV中的Anhinga/93替換成F或HN基因能顯著提高病毒巨噬細胞的復(fù)制能力凹。3.3HN促進效應(yīng)細胞的活化和腫瘤細胞凋亡免疫系統(tǒng)中大部分細胞都可表達TRAIL,單核-巨噬細胞和樹突狀細胞接受I型干擾素(IFN-a)和II型干擾素(IFN-Y)刺激后，可以檢測到TRAIL的表達凹。其原因是病毒感染后，干擾素表達水平上調(diào)，繼而誘導TRAIL表達。體內(nèi)試驗也表明，鼠肝臟NK細胞在經(jīng)受IFN-Y刺激后，TRAIL表達上調(diào)，增強了NK細胞抑制腫瘤細胞向肝臟轉(zhuǎn)移的細胞毒性叫。研究發(fā)現(xiàn)，M經(jīng)NDV剌激后，可殺傷各種人類腫瘤細胞，M中的殺腫瘤特性正是通過TRAIL介導的叫NDV誘導M。表達TRA

19、IL時不依賴于病毒的復(fù)制，經(jīng)紫外線滅活的NDV0燃具有誘導TRAIL表達的效果。進一步研究也證實，HN蛋白介導了NDV刺激下外周血單核細胞對IFN-a和TRAIL分泌的調(diào)節(jié)作用問。3 HN蛋白抑制腫瘤的應(yīng)用前景鑒于在I期臨床應(yīng)用時使用NDV感染治療有散毒的潛在危險，目前的研究方向是將NDV的抗腫瘤HN基因進行克隆，以抗腫瘤基因的真核重組體的表達產(chǎn)物取代完整病毒，從而克服了完整病毒所引起的副作用及可能帶來的風險，進而確保安全性和細胞疫苗無法比擬的優(yōu)越性，這為HN作為生物制劑替代NDV全病毒用于抗腫瘤治療提供了科學依據(jù)。在由NDV介導的抗腫瘤過程中，HN蛋白具有增加腫瘤細胞對淋巴細胞的粘附力、刺激

20、淋巴細胞的分化和改變腫瘤細胞免疫原性的作用，因此，HN蛋白是NDV抗腫瘤作用的主要分子基礎(chǔ)，在人類腫瘤性疾病生物防控中具有較高的研究和應(yīng)用價值。NDV抗腫瘤作用的機制之一是通過病毒感染腫瘤細胞，增強腫瘤細胞的免疫原性，刺激機體免疫系統(tǒng)針對腫瘤抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，進而殺傷腫瘤細胞。但目前的研究與應(yīng)用大部分還都局限于全病毒修飾疫苗或NDV溶痛株體外裂解瘤細胞，而后再回輸入體內(nèi)。顯然，利用這種方法抑制腫瘤存在一定的風險。具體體現(xiàn)在：(1)利用病毒進行體內(nèi)實驗時不可避免地會產(chǎn)生抗體，這些抗體在很大程度上限制了病毒的反復(fù)使用，這是制約NDV進一步應(yīng)用于抗腫瘤臨床治療的關(guān)鍵技術(shù)問題之一。(2)若體內(nèi)試驗中瘤

21、細胞滅活或裂解不徹底，會產(chǎn)生人為種植腫瘤的危險。(3)NDV可能對機體造成感染，存在散毒的風險，并且其非有效成分還町能導致機體出現(xiàn)過敏反應(yīng)。盡管如此，利用NDV治療腫瘤的研究方興未艾，它是一種令人鼓舞的基因治療手段。但生物療法畢竟尚未完全成熟，尤其是、DV抗腫瘤的確切機制尚未完全闡明，因此，在該領(lǐng)域還需進行更深一步的研究和探索。參考文獻：(1JGuM,LiuWJ,XuLJ,etal.Positiveselectioninthehemagglutinin-neuraminidasegeneofNewcastlediseasevirusanditseffectonvaccineeflicacyfj

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