單核細(xì)胞中性粒細(xì)胞分離方法及注意事項(xiàng)

1、單核細(xì)胞分離方法將用等體積生理鹽水稀釋的抗凝血，加入塑料離心管中的Ficoll Hypaque分離液表面，以450 g離心25min收集單個(gè)核細(xì)胞，用10 小牛血清的RPMI一1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，置于6x 6 cm 玻璃培養(yǎng)皿中，在5 CO2 、37 下孵育2 h，收集貼壁的單核細(xì)胞。用0.2乳白蛋白的RPMI-1 640培養(yǎng)液懸浮單核細(xì)胞，Wright染色計(jì)數(shù)單核細(xì)胞>95，調(diào)整細(xì)胞密度為4×10ml。將細(xì)胞懸液加入24孔培養(yǎng)板中，在5 CO2，37 下培養(yǎng)24 h，離心收集上清液，凍存于一70 冰箱中備用。細(xì)胞培養(yǎng)前后臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞存活率。細(xì)胞分離中需要注意的幾個(gè)

2、問題1.如果您要做細(xì)胞培養(yǎng)，記住實(shí)驗(yàn)中所用的試劑（分離液，洗滌液等）、器械等都要是無(wú)菌消毒的，并注意實(shí)驗(yàn)中的無(wú)菌操作。2. 離心轉(zhuǎn)速單位及時(shí)間：目前國(guó)外的文獻(xiàn)報(bào)道基本上用g為單位，注意g和轉(zhuǎn)速（rpm）的換算。3.離心溫度：有的要求室溫，有的要求4攝氏度。實(shí)驗(yàn)的操作要求盡可能熟練，連貫。4.在用Ficoll分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）時(shí)，通常含有少量的紅細(xì)胞，對(duì)于一般的實(shí)驗(yàn)影響不大，如果實(shí)驗(yàn)要求較高，可采取裂解液（有的需要無(wú)菌），并注意裂解時(shí)間控制，以免影響單個(gè)核細(xì)胞的活性。5. 在用Percoll配不連續(xù)梯度時(shí)（一般用高滲NaCl），注意各成份體積的準(zhǔn)確性，否則密度與預(yù)期的不一樣，影響分離效果

3、。6.用全血離心效果比全血稀釋后再離心效果差，稀釋一般等體積稀釋一倍。7.分離液與樣本的體積比：一般應(yīng)小于1：2（即一般為1體積分離液，2體積樣本，不宜超過(guò)2體積，小于2體積均可）8.洗滌液的成分：不同文獻(xiàn)報(bào)道不一，有的使用PBS，有的為Hanks，KRP等，可自己選定。主要是離子濃度及成份的不同，有的含有 Mg2+,Ca2+。9. 細(xì)胞活性：0.2%臺(tái)盼藍(lán)染色35分鐘，鏡下觀察計(jì)數(shù)死亡細(xì)胞（藍(lán)染）。中性粒細(xì)胞分離的方法1、標(biāo)準(zhǔn)方法：Ficoll-泛影鈉（Ficoll-Hypaque）密度梯度及紅細(xì)胞裂解法2）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無(wú)血小板血漿（platelet-p

4、oor Plasma, PPP）。3）余下的沉降全血加入5ml6%Dextran (分子量500,000，用無(wú)菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調(diào)節(jié)最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。4）吸出富含白細(xì)胞的上層液，275gX6min。5）沉淀的細(xì)胞用8mlPPP-生理鹽水（1：4）重懸，并移到15ml離心管中。6）懸液細(xì)胞上面加入3mlFicoll-Hypaque（密度1.077），750gX5min，室溫。7）吸取富含中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞層，用0.155MNH4Cl重懸細(xì)胞，使紅細(xì)胞裂解，然后中性粒細(xì)胞用含0.25%BSA Hanks平衡液（HBSA，無(wú)鈣）洗2次，最

5、終用HBSA（含鈣）重懸。8）用此法可得95%以上的中性粒細(xì)胞。2、不連續(xù)的密度梯度血漿Percoll離心法 1）先制備Percoll儲(chǔ)存液：Percoll原液（100%）:0.9%NaCl的體積比為9：1。3）吸出富含血小板的上清，2500gX15min，制備無(wú)血小板血漿（platelet-poor Plasma, PPP）。4）余下的沉降全血加入5ml6%Dextran (分子量500,000，用無(wú)菌生理鹽水配制)，并用生理鹽水（0.9%）調(diào)節(jié)最終體積至50ml，輕輕、徹底混勻。室溫沉降30min。5）吸出富含白細(xì)胞的上層液，275gX6min。6）沉淀的細(xì)胞用23mlPPP重懸7）在一15ml離心管中依次加入2ml42%、2ml51%Percoll(均為用PPP新鮮配制)、23ml細(xì)胞懸液，275gX10min.8）單個(gè)核細(xì)胞及部分血小板位于血漿與42%Percoll液之間，中性粒細(xì)胞位于42%Percoll與51%Percoll之間。血小板可通過(guò) 25%Percoll離心5min去除，也可在原密度梯度中加入第三個(gè)25%Percoll一起離