六味地黃湯對糖皮質(zhì)激素腎陰虛模型免疫器官淋巴細胞凋亡的抑制作用(I)

1、    六味地黃湯對糖皮質(zhì)激素腎陰虛模型免疫器官 淋巴細胞凋亡的抑制作用(I)          摘要：為進一步探討腎陰虛證在免疫學(xué)上的實質(zhì)，將30只Wister大鼠分為正常對照組、模型組、六味地黃湯組3組，采用糖皮質(zhì)激素腎陰虛大鼠模型以原位末端標記法標記凋亡細胞，觀測了六味地黃湯對胸腺淋巴細胞凋亡的影響。結(jié)果顯示：模型組淋巴細胞凋亡增多，且多在胸腺皮質(zhì)部，凋亡細胞計數(shù)模型組顯著高于正常對照組(P0.01)；六味地黃湯組淋巴細胞凋亡較模型組明顯減少，凋亡細

2、胞計數(shù)六味地黃湯組低于模型組(P0.01)。提示六味地黃湯能夠抑制糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺淋巴細胞凋亡。反證了腎陰虛證存在胸腺淋巴細胞凋亡的情況，而滋補腎陰的藥物可以對其有抑制作用。主題詞：腎陰虛/免疫學(xué)；六味地黃湯/藥理學(xué)；淋巴細胞/藥物作用；脫噬作用/藥物作用；胸腺/藥物作用中分類號：R318.15文獻標識碼：A文章編號：1007-3213(2000)03-0204-03Inhibitory Effect of Liuwei Dihuang Decoction on Lymphocyte Apoptosis in Immune Organ of Glucocorticoid-induced K

3、idney-yin-deficiency Animal Model()DU Biaoyan，XU Qin，WU Shaofeng，LUO Hui，SU Junfang，ZHONG Tingji （Dept. of Pathology, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, China）Abstract: To further explore the immunological mechanism of kidney-yin-deficiency syndrome, Wistar rats were allocated to three g

4、roups: normal control group, model group and Liuwei Dihuang Decoction (LDD) group. The kidney-yin-deficiency rat model was induced by glucocorticoid and thymocyte apoptosis was measured with in situ end labeling technique. The results showed that lymphocyte apoptosis was obvious in the model group a

5、nd mainly in thymic cortex. The number of apoptotic lymphocytes was increased in the model group as compared with that in the normal control group (P0.01) and was decreased in LDD group as compared with the model group (P0.01). It is indicated that lymphocyte apoptosis exists in the thymus gland of

6、kidney-yin-deficiency rat model, and LDD with the action of nourishing kidney-yin can inhibit glucocorticoid-induced lymphocyte apoptosis in the thymus gland.Key words: KIDNEY-YIN DEFICIENCY/immunol.;LIUWEI DIHUANG DECOCTION/pharmacol.;LYMPHOCYTES/drug eff.;APOPTOSIS/ drug eff.;THYMUS GLAND/ drug ef

7、f在既往“腎與免疫關(guān)系”的研究中發(fā)現(xiàn)，糖皮質(zhì)激素腎陰虛模型的胸腺出現(xiàn)萎縮，而滋陰 補腎中藥對造型過程中引起的胸腺萎縮有拮抗作用1，2，并且大量的研究證明，糖皮質(zhì)激素能誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡3，4。糖皮質(zhì)激素增多可誘導(dǎo)免疫器官內(nèi)的淋巴細胞凋亡，細胞數(shù)目減少，體積縮小，重量減輕，免疫器官出現(xiàn)萎縮。為進一步探討腎陰虛證的免疫學(xué)實質(zhì)，我們觀察了六味地黃湯對糖皮質(zhì)激素腎陰虛動物模型胸腺細胞凋亡的抑制作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。1材料與方法1.1動物Wister大鼠，體重5070g，健康、雌雄各半，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。1.2試劑及藥物細胞凋亡檢測試劑盒(in situ cell death detec

8、tion,POD)，德國Boehringer Mamuheim公司產(chǎn)品(NO.1684817)。氫化可的松注射液，揚州制藥廠產(chǎn)品，20mL/支(5g/L)，批號：980403。六味地黃湯，由熟地黃24g、山茱萸12g、淮山藥12g、澤瀉9g、茯苓9g、牡丹皮9g組成。上述藥材由本校第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)本校中藥鑒定教研室張丹雁老師鑒定。將上述藥材置陶器內(nèi)加水1L浸泡1h后煎煮，沸后1h取出藥液，藥渣再加水煎煮1h，將兩次藥液混合濃縮至75mL(每mL含生藥1g)，用雙層紗布過濾后置4冰箱中保存?zhèn)溆谩?.3分組及給藥取大鼠30只，隨機分為3組，每組10只。正常對照組：蒸餾水灌胃1mL/d，共

9、5d，第3天起肌注生理鹽水0.2mL/d，共3d。模型對照組：蒸餾水灌胃1mL/d共5d后，第3天始按腎陰虛造模方法5，肌注氫化可的松0.2mL/d，共3d。六味地黃湯組：六味地黃湯灌胃1mL/d，5d，第3天始按腎陰虛造模方法5，肌注氫化可的松0.2mL/d，共3d。給藥結(jié)束后斷頭處死動物，取出胸腺進行凋亡細胞原位末端標記及觀察。1.4凋亡細胞原位末端標記石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，微波10min，PBS洗5min，3H2O2    1各組胸腺皮質(zhì)、髓質(zhì)光鏡下細胞凋亡情況a、b正常對照組胸腺皮質(zhì)；c、d模型組胸腺皮質(zhì)；e、f六味地黃湯組胸腺皮質(zhì)、胸腺髓質(zhì)2結(jié)

10、果2.1光鏡觀察正常對照組：在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位均能見被著染成棕黃色的凋亡細胞，陽性細胞占整個胸腺細胞比例較少(見封底本文1-a、b)。模型對照組：在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見棕黃色的凋亡細胞較正常對照組明顯增多，陽性細胞占整個胸腺細胞的比例增大(見封底本文1-c、d)。六味地黃湯組：在胸腺皮質(zhì)及髓質(zhì)部位見棕黃色的凋亡細胞似較正常對照組增多，但較模型對照組明顯減少(見封底本文1-e、f)。2.2凋亡細胞計數(shù)見表1。3組切片凋亡細胞數(shù)經(jīng)方差分析，差別有非常顯著意義。模型對照組凋亡細胞數(shù)比正常組多(P0.01)，說明糖皮質(zhì)激素確有誘導(dǎo)淋巴細胞凋亡作用，而六味地黃湯組凋亡細胞數(shù)比模型組少(P0.01)，并

11、接近正常對照組(P0.05)，提示六味地黃湯對氫化可的松誘導(dǎo)的淋巴細胞凋亡具有抑制作用。組別N/只N凋亡細胞/(個*視野-1)正常對照組1081.32±45.25模型對照組10246.26±110.70*六味地黃湯組1096.42±83.08     3組經(jīng)方差分析P0.01；組間比較，t檢驗：*與正常對照組比較，P0.01；與模型組比較，P0.01 3討論細胞凋亡(apoptosis)，又稱為細胞程序性死亡或脫噬作用(PCD)，由Kerr于1972年提出3。它是一種主動的由基因調(diào)控，不同于壞死的細胞死亡形式。其形態(tài)學(xué)特征是

12、：細胞體積變小，胞漿濃縮，核仁消失，染色質(zhì)裂解和固縮，聚積在核膜周圍一側(cè)，呈半圓形斑塊，進而細胞膜內(nèi)陷將細胞分割為一個或多個由質(zhì)膜包裹，內(nèi)有細胞器及核成分的小體，即凋亡小體(apoptosisbody)。其生化特征是：由于細胞內(nèi)核酸內(nèi)切酶活性增高，DNA被剪切成單一的和寡聚的核小體DNA片段(180-200bp或其倍數(shù))，在瓊脂糖凝膠電泳上呈梯狀條帶4。細胞凋亡與免疫系統(tǒng)中免疫細胞的發(fā)育分化及行使功能等各個方面有著密切的聯(lián)系?，F(xiàn)有研究表明68：凋亡參與淋巴器官中免疫細胞的成熟和淋巴細胞抗原受體譜的發(fā)育；凋亡作為一種調(diào)節(jié)機制，直接制約免疫應(yīng)答的過程和強度；凋亡還決定免疫耐受的形成和免疫記憶的產(chǎn)生

13、等。由于細胞凋亡與免疫系統(tǒng)的密切聯(lián)系，因而免疫細胞的凋亡成為免疫學(xué)研究的熱點之一。由于細胞凋亡參與免疫系統(tǒng)中免疫細胞的發(fā)育分化及行使動能等各個方面，免疫細胞凋亡的異常必將嚴重影響機體免疫系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。探討具有免疫調(diào)節(jié)作用藥物對免疫細胞凋亡的影響，對揭示該藥物的免疫藥理作用機制具有重要意義。尋找免疫細胞凋亡調(diào)節(jié)藥物有利于免疫細胞凋亡相關(guān)疾病的治療。曾有研究表明，糖皮質(zhì)激素水平升高是腎陰虛證患者體內(nèi)重要病理改變之一，同時腎陰虛證患者多表現(xiàn)為免疫功能的低下或紊亂5，9，其機制可能與糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)淋巴細胞，特別是胸腺細胞凋亡有關(guān)。六味地黃湯是公認的治療腎陰虛證的經(jīng)典古方，臨床及實驗證實六味地黃湯具

14、有改善腎陰虛證機體免疫狀態(tài)的作用4，10。本實驗結(jié)果進一步說明了腎陰虛證的免疫學(xué)基礎(chǔ)可能與淋巴細胞過度凋亡有關(guān)，而六味地黃湯能抑制這種凋亡，亦反證了腎陰虛證的這一本質(zhì)。糖皮質(zhì)激素參與體內(nèi)的應(yīng)激過程，過度的應(yīng)激反應(yīng)，特別是慢性應(yīng)激反應(yīng)，能引起應(yīng)激性的免疫功能低下11。本研究結(jié)果表明，六味地黃湯能拮抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的淋巴細胞凋亡作用。提示該方可能在各種應(yīng)激引發(fā)的免疫功能低下的保健預(yù)防及治療中具有一定的應(yīng)用前景。淋巴細胞凋亡異常是一些免疫相關(guān)性疾病(如放射、化療、愛滋病等引起的繼發(fā)性免疫缺陷病)產(chǎn)生的重要病理學(xué)基礎(chǔ)，或在發(fā)生發(fā)展過程中出現(xiàn)淋巴細胞凋亡而使疾病惡化進展12。六味地黃湯具有拮抗淋巴細胞凋

15、亡的作用，該方對上述疾病的預(yù)防和治療可能會有一定的效果。(熱帶醫(yī)學(xué)研究所張奉學(xué)老師為本研究提供了大力幫助，特此致謝!)基金項目：廣東省中醫(yī)藥管理局課題(編號 97072)作者簡介：杜標炎(1962-)，男，副教授杜標炎（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）徐勤（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）吳紹鋒（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）羅惠（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）蘇俊芳（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）鐘廷機（廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室，廣州510405）參考文獻：1杜標炎.腎陰虛造型及補腎中藥對小鼠免疫功能的影響J.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)

16、報，1995，12(4)：302杜標炎，徐勤，羅惠，等.六味地黃湯抗糖皮質(zhì)激素所致小鼠胸腺萎縮的病理學(xué)研究J.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1999，16 (2)：1113Kerr J F R,Wyllie A H,Currie A R.Apoptosis: basic biological phenomenon with wideranging implication in tissue kinesticsJ.Br J Cancer, 1972,26:2394Wyllie A H.Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with

17、 endogenous endonuclear activationJ.Nature,1980,284:5555陳小野.脾虛和腎虛動物模型的研究思路J.中國醫(yī)藥學(xué)報，1988，3 (1)：646Krammer P H, Berhmann I,Daniel P,et al.Regulation of apoptosis in the immune systemJ. Curr Opin Immunol,1994,6:4767Williams G T.Apoptosis in the immune system:concepts and questionsM.In:Apoptosis and the immune responses. New York:Willey