凋亡細胞促進狼瘡性BXSB小鼠發(fā)病的研究

1、凋亡細胞促進狼瘡性BXSB小鼠發(fā)病的研究         05-12-16 10:38:00     作者：佚名    編輯：studa9ngns【摘要】目的探討凋亡細胞在系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病中的作用。方法將體外誘導的凋亡胸腺細胞經(jīng)腹腔注射給同基因同性別的正常C57小鼠和具有狼瘡傾向的雌雄BXSB小鼠；檢測血清中IgM和IgG類型的抗dsDNA抗體和抗ssDNA抗體的水平，尿蛋白濃度以及腎臟中IgG類型免疫復合物的沉積。結(jié)果用凋亡胸腺細胞

2、免疫后，誘導C57小鼠產(chǎn)生IgG類型的抗dsDNA抗體和抗ssDNA抗體；相比之下，誘導雌性BXSB小鼠產(chǎn)生更高水平的IgG類型抗dsDNA抗體和抗ssDNA抗體；并且使雄性BXSB小鼠的尿蛋白濃度顯著升高。結(jié)論凋亡細胞具有免疫原性，它可能是狼瘡性BXSB小鼠體內(nèi)自身抗原的主要來源；狼瘡性遺傳因素和Yaa基因能促進凋亡細胞的免疫原性和增強凋亡細胞的致腎炎作用。 Apoptotic cells accelerate the development of systemic lupus erythematosus in lupus-prone BXSB mice  【Abstract】Ob

3、jectiveTo probe into the role of apoptotic cells in the disease development of systemic lupus erythematosus.MethodsApoptotic thymocytes injected intraperitoneally into syngeneic normal C57 mice and lupus-prone BXSB mice,and then the level of anti-dsDNA and anti-ssDNA antibodies of IgM and IgG classe

4、s,and the concentration of urine protein and immune complex of IgG class deposited in kidney were detected.ResultsThe apoptotic thymocytes induced the production of anti-dsDNA and anti-ssDNA antibody of IgG class in C57 mice,and their levels were higher in female BXSB mice than in male ones.The conc

5、entration of urine protein of male BXSB mice injected with apoptotic thymocytes was noticeably higher than that of&nb sp;the control male BXSB mice.ConclusionApoptotic cells have immunogenicity,and may be the major source of autoantigens in lupus BXSB mice.Lupus genetic factors and Yaa gene can

6、potentiate the immunogenicity of apoptotic cells or accelerate their inducing the lupus nephritis. 【Key words】Apoptosis;Mice,BXSB;Lupus erythematosus,systemic 現(xiàn)在普遍認為系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的發(fā)病機制涉及多個環(huán)節(jié)，并受遺傳因素的控制和環(huán)境的影響1。自身抗體的產(chǎn)生和免疫復合物的形成是狼瘡性免疫復合物型腎炎等免疫病理改變的直接原因。動物實驗結(jié)果提示，狼瘡性小鼠IgG類型的抗DNA抗體是自身抗原誘導的特異性體液免疫應答的結(jié)果2。體內(nèi)的染色

7、質(zhì)(chromatin)及核小體(nucleosome)可能是主要的自身抗原3，但其產(chǎn)生來源不清楚。最近，我們實驗室發(fā)現(xiàn)發(fā)病的狼瘡性雄性BXSB小鼠的凋亡B細胞數(shù)量異常升高4。另有報道，在體外SLE病人的凋亡淋巴細胞也異常增加5。基于上述現(xiàn)象，我們分別將凋亡的胸腺細胞經(jīng)腹腔注射給同基因(syngeneic)同性別的正常C57小鼠和處于發(fā)病之前的狼瘡性遺傳傾向的雌雄BXSB小鼠，人為地增加體內(nèi)凋亡細胞的數(shù)量，以探討凋亡細胞與自身抗體產(chǎn)生和腎炎病變的關(guān)系，以及在此過程中狼瘡性遺傳因素的影響。 1材料與方法 1.1實驗動物：4周齡C57小鼠，購自中國科學院遺傳學研究所；4周齡雄性和雌性BXSB小鼠，

8、由北京醫(yī)科大學第三臨床醫(yī)學院皮膚科陳學榮教授自美國Jackson實驗室引進，本室飼養(yǎng)繁殖。 1.2凋亡細胞的誘導及收集：取同基因同性別的4周齡小鼠的胸腺細胞，用含10%FCS(hyclone)的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1×107/ml濃度，加地塞米松(Dex)至105 mol/L濃度，在37 ，5%CO2的條件下，誘導細胞凋亡24 h。然后，收集胸腺細胞，用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌3次。經(jīng)PI染色，用流式細胞儀檢測亞二倍體細胞數(shù)作為胸腺凋亡細胞的數(shù)量。 1.3免疫過程：分別將4周齡C57小鼠和雌雄BXSB小鼠隨機分成兩組，即實驗組和對照組，每組5只小鼠。實驗組每只小鼠經(jīng)腹腔注

9、射0.2 ml體積的含5×107同性別同基因的凋亡胸腺細胞。每隔10 d注射1次，共注射免疫3次。對照組每只小鼠經(jīng)腹腔注射0.2 ml體積的RPMI-1640培養(yǎng)液，注射的次數(shù)及間隔時間同實驗組。 1.4免疫學檢測：末次注射的10 d后，留取實驗組和對照組小鼠的血清、尿液和腎臟。 血清作150稀釋，用ELISA法檢測IgM和IgG類型的抗ssDNA和抗dsDNA抗體，其濃度以ELISA底物顯色的A值示之。 用考馬斯亮蘭G-250液測定尿液中尿蛋白濃度6，作為腎炎有無或程度的指標。 用二乙酰單肟法測定血清中尿素氮(BUN)的濃度，作為腎功能狀態(tài)的指標。試劑盒購自北京北化精細化學品公司臨

10、床診斷試劑分廠，實驗方法按說明書進行。 留取的腎臟經(jīng)冰凍切片后，用免疫熒光法7檢測腎臟有無IgG類型免疫復合物(IC)的沉積。 2結(jié)果  ;2.1IgM類型抗DNA抗體的水平：胸腺細胞經(jīng)105 mol/L Dex誘導24 h后，PI染色，用FACS檢測，發(fā)現(xiàn)約83%細胞是亞二倍體的凋亡細胞。各個實驗組小鼠與相應的對照組小鼠血清中IgM類型的抗dsDNA和抗ssDNA抗體水平差異無顯著性(P0.05)。并且，正常C57小鼠和雌雄BXSB小鼠的血清中IgM類型的抗dsDNA和抗ssDNA抗體水平相似。 此外，雖然實驗組雄性BXSB小鼠血清中IgG類型的抗dsDNA和抗ssDNA抗體的平均

11、水平高于其對照組小鼠，但增加的幅度并無顯著性。 2.3凋亡細胞加重雄性BXSB小鼠的狼瘡腎炎：正常C57小鼠的實驗組和對照組以及雌性BXSB小鼠的實驗組和對照組之間尿蛋白濃度差異無顯著性(P0.05)，并且都處于正常范圍內(nèi)。所有雄性BXSB小鼠的尿蛋白濃度均已高于正常范圍，表明腎臟出現(xiàn)炎癥反應。但是，雄性BXSB小鼠實驗組的尿蛋白濃度比對照組的顯著升高(P0.05)，提示凋亡胸腺細胞進一步加重了實驗組雄性BXSB小鼠的腎炎病變程度。 免疫熒光法檢測的結(jié)果顯示，C57小鼠與雌性BXSB小鼠的實驗組和對照組的腎臟均無IgG型IC的沉積。而雄性BXSB小鼠的實驗組和對照組的腎臟均有IgG型IC的沉積

12、。但是，由于方法的限制，未對兩組小鼠腎臟IC的沉積程度作精確定量性的鑒定和區(qū)分。 無論是正常C57小鼠還是狼瘡遺傳傾向的雌雄BXSB小鼠，實驗組和對照組小鼠之間的血清BUN水平差異無顯著性(P0.05)，并且都處于正常范圍內(nèi)。表明凋亡細胞在誘導抗DNA抗體產(chǎn)生的體液免疫應答過程中，雖然加重了雄性BXSB小鼠的腎炎病變程度，但還沒有達到引起腎臟功能衰竭的程度。 3討論 BXSB小鼠是具有狼瘡遺傳傾向的自發(fā)性SLE小鼠模型之一8，9。由于Y染色體上帶有Yaa基因，使得雄性BXSB小鼠的發(fā)病較雌性小鼠早且嚴重8，一般雄性鼠從2月齡開始發(fā)病，67個月齡時近半數(shù)死亡，而雌性小鼠在1年半時才有半數(shù)死亡8。

13、因此，在本實驗開始時所有BXSB小鼠的鼠齡在2個月之內(nèi)，處于SLE發(fā)病的前期。此外，C57小鼠(H-2b)的MHC與BXSB小鼠(H-2b)的相同，因而以同齡C57小鼠作為正常對照。 實驗組的C57小鼠和雌雄BXSB小鼠經(jīng)凋亡胸腺細胞免疫后，IgM類型的抗dsDNA和抗ssDNA抗體水平與各自對照組小鼠的相似，表明凋亡胸腺細胞的免疫并無促進IgM類型抗DNA抗體的產(chǎn)生。在C57小鼠和BXSB小鼠的血清中存在著水平相近的IgM類型抗DNA抗體可能是B細胞多克隆活化的產(chǎn)物，一種生理性的自身抗體。 血清中IgG類型的抗DNA抗體的檢測結(jié)果顯示，經(jīng)凋亡的胸腺細胞免疫后的確誘導了正常C57小鼠產(chǎn)生IgG類型的抗dsDNA和抗ssDNA抗體。