低溫條件下相關關鍵酶活性對棉纖維比強度形成的影響

1、低溫條件下相關關鍵酶活性對棉纖維比強度形成的影響卞海云，王友華，陳兵林，束紅梅，周治國（南京農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/農(nóng)業(yè)部作物生長調(diào)控重點開放實驗室，南京 210095）摘要：【目的】研究低溫對纖維比強度形成的影響?！痉椒ā客ㄟ^設置大田分期播種試驗，使相同果枝部位棉鈴可以處于不同的溫度條件下發(fā)育，研究低溫對棉纖維發(fā)育關鍵酶活性及相關基因表達的影響?！窘Y果】低溫影響纖維素的累積速率并最終影響纖維比強度的形成，其原因是在不同水平上影響了纖維發(fā)育關鍵酶的活性。在生化水平上，低溫（鈴齡050 d日均溫<23.0，鈴齡2550 d日均溫<21.0）提高了纖維中-1,3-葡聚糖酶的活性、降低了蔗糖合成

2、酶的活性，且前者對溫度更為敏感。在基因表達水平上，低溫使Expansin、蔗糖合成酶基因的表達量增加，-1,3-葡聚糖酶基因的表達與此相反，低溫下Expansin到達表達峰值時間推后且維持高表達的時間延長，低溫可導致15 d鈴齡纖維-1,3-葡聚糖酶基因表達量顯著降低，而蔗糖合成酶基因表達量顯著升高。【結論】在纖維品質(zhì)形成上，低溫導致棉纖維伸長期及伸長高峰推后，低溫下纖維素累積量、纖維比強度的變化特征與纖維蔗糖合成酶活性及-1,3-葡聚糖酶基因表達的變化特征高度一致，與-1,3-葡聚糖酶活性及蔗糖合成酶基因表達受低溫影響的規(guī)律相反。關鍵詞：低溫；Expansin；-1,3-葡聚糖酶；蔗糖合成酶

3、；基因表達；纖維發(fā)育；纖維比強度Effects of the Key Enzymes Activity on the Fiber Strength Formation Under Low Temperature ConditionBIAN Hai-yun, WANG You-hua, CHEN Bing-lin, SHU Hong-mei, ZHOU Zhi-guo (College of Agronomy, Nanjing Agricultural University / Key Laboratory of Crop Growth Regulation, Ministry of Agric

4、ulture, Nanjing 210095)Abstract: 【Objective】This experiment was carried out to study the effects of low temperature on cotton fiber strength development.【Method】The effects of low temperature on the dynamics of several key enzymes activity and the gene expression pattern were studied by setting diff

5、erent seeding times, thus the fiber developing process can be arranged at different temperature conditions.【Result】 The results showed that the dynamics of the enzymes activity and the genes expression were influenced in by low temperature conditions. At the biochemical level, the activity of the -1

6、,3-glucanase was decreased with the increasing of the temperature while the sucrose synthetase activity behaved oppositely. Evidences also showed that the -1,3-glucanase were much more sensitive to temperature variation than sucrose synthetase. At the gene expression level, the effect of low tempera

7、ture (mean daily temperature of 0-50 DPA (days post anthesis) and 25-50 DPA was lower than 23.0 and 21.0, respectively) on different genes expression was quite different. At low temperature, the expression of the -1,3-glucanase gene was remarkably inhibited in the days around the 15 DPA and the high

8、 expression period of the expansin gene was prolonged. For the fiber strength development, the peak of the fiber elongation was prolonged and that was accordant with the variation of the expression pattern of the expansin gene, the -1,3-glucanase and the sucrose synthetase gene. 【Conclusion】 The var

9、iation of the cellulose deposition and the textile processing was highly accordant with the changes of the -1,3-glucanase gene expression pattern and variation of the dynamics of sucrose synthetase activity, while it was absolutely opposite to the changes of the sucrose synthetase gene expression pa

10、ttern and variation of the dynamics of -1,3-glucanase activity. Key words: Low temperature; Expansin; -1,3-glucanase; Sucrose synthetase; Gene expression; Fiber development; Fiber strength0 引言【研究意義】近年來，隨著棉花多熟制種植面積不斷擴大，棉花秋桃、晚秋桃在棉花產(chǎn)量中的比重不斷增加，棉花屬喜溫型作物，低溫嚴重影響秋桃、晚秋桃纖維品質(zhì)的形成1,2，而纖維比強度又是纖維品質(zhì)的重要指標，因此低溫對棉纖維比強

11、度形成的影響已引起人們的高度重視。【前人研究進展】成熟棉纖維90%以上的成分是纖維素，纖維比強度與纖維素的累積、纖維伸長和加厚過程中相關酶的作用密切相關。目前的研究表明，在參與纖維發(fā)育的眾多已知調(diào)節(jié)因子中，膨脹素（Expansin）35、-1,3-葡聚糖酶6、蔗糖合成酶7,8與纖維的發(fā)育關系更為密切：Expansin在纖維細胞伸長過程與胞壁松弛過程中起作用，它在細胞壁中的纖維素微纖絲和基質(zhì)多糖交叉處，以一種可逆（非水解）方式打開限制纖維伸長的纖維素微原纖和纖維素-木葡聚糖間的氫鍵，促使聚合物滑動并引起細胞壁的伸展，讓新近合成的細胞壁原料以可控的方式沉積35，從而促進纖維的伸長和加厚；蔗糖合成酶

12、（sucrose synthetase，SuSy或SS3）是纖維素合成直接底物尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）合成的關鍵性酶，質(zhì)膜上纖維素合成酶復合體與蔗糖合成酶相連并可直接接受由蔗糖合成酶催化產(chǎn)生的UDPG合成纖維素。研究表明，蔗糖合成酶的mRNA水平在整個生長階段基本保持不變810；盡管-1,3-葡聚糖酶是纖維素生物合成的媒介還沒有直接證據(jù)，但研究表明在纖維素大量沉積時，需要-1,3-葡聚糖酶的高活性和高表達11。棉纖維是種皮細胞壁突起形成的，關于低溫條件下棉纖維比強度形成的研究，大多停留在纖維物理參數(shù)及相關生化指標的測定水平12, 13，其中蔣光華研究認為棉纖維加厚發(fā)育期（鈴齡2550 d）

13、24.0左右的日均溫是高強纖維形成的最佳溫度，低于21.0時即對棉纖維加厚發(fā)育相關酶活性產(chǎn)生明顯影響，纖維比強度降低，當溫度降到15.0 左右時，棉纖維不能正常發(fā)育13?！颈狙芯壳腥朦c】但在分子水平上針對上述纖維發(fā)育關鍵酶活性及其基因表達在棉花上的相關研究、以及對溫度等生態(tài)因子的響應未見報道，而這對深入了解纖維比強度形成機制、明確高質(zhì)纖維棉花品種的分子育種方向、并在農(nóng)藝上采取合理有效的措施穩(wěn)定和提高纖維品質(zhì)都具有重要意義?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬通過設置不同播期試驗，使棉纖維發(fā)育過程處于不同的溫度條件下，同時在生化水平及基因表達水平上研究低溫條件下棉纖維發(fā)育關鍵酶的動態(tài)變化特征，并結合纖維

14、素累積及纖維比強度的特征分析，探討棉花纖維比強度形成的生理和分子機制，為棉花高強纖維形成的分子育種和生理調(diào)控提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 試驗設計試驗于2004年在南京農(nóng)業(yè)大學衛(wèi)崗試驗站進行，采用盆栽方法。供試土壤為黃棕壤土，土壤有機質(zhì)含量15.3 g·kg-1，全氮含量0.8 g·kg-1，速效磷含量39.97 mg·kg-1，速效鉀含量237.5 mg·kg-1。供試品種為美棉33B（Gossypium hirsutum L.）。為形成棉鈴發(fā)育期的低溫條件，試驗設置2個播期：5月11日（T1）和6月16日（T2），每個播期40盆。待棉花開花后，

15、分別對棉花23、68、1112果枝1、2果節(jié)的當日白花掛牌標記，分別取鈴齡7、15、25 d的棉鈴810個，將纖維和種子分開，纖維液氮冷凍后，一部分保存在-20下，一部分保存在-70下備用。棉花按常規(guī)高產(chǎn)栽培要求進行管理，開花后50 d收獲處理棉鈴。試驗所用氣象資料來自南京氣象局，棉纖維不同發(fā)育階段日均溫見表1。1.2 試驗方法用瑞典Tecator纖維系列儀測定棉花纖維素含量。用流水沖洗法測定未成熟纖維長度17。纖維比強度的測定是混勻纖維樣品后用棉花纖維引伸器制成棉條，用國產(chǎn)Y162A型束纖維強力機測定3.2 mm隔距比強度，測6次重復，平均值作為試樣代表值，并用中國纖維檢驗局標準棉樣修正。用

16、果糖和UDPG比色法測定蔗糖合成酶活性14，用昆布多糖比色法測定-1,3-葡聚糖酶活性15，-1,3-葡聚糖酶一個酶活力單位（U）定義為每秒從還原昆布多糖中釋放出1 nmol葡萄糖所需的酶量，酶活性以每克鮮樣重的酶活力單位表示。用CTAB/酸酚法提取總RNA16。以梯度總RNA量及梯度循環(huán)數(shù)確定可區(qū)分表達強度差異的最佳PCR循環(huán)數(shù)。等量總RNA進行RT-PCR，反應條件：42 1 h；94 5 min；94 30 s，退火溫度 30 s，72 30 s，合適循環(huán)數(shù)；72 5 min。所用引物、退火溫度及循環(huán)數(shù)見表2。表1 棉纖維不同發(fā)育階段日均溫（）Table 1 Mean daily tem

17、perature at different stages of cotton fiber development播期Seeding time果枝部位Fruiting branch position日均溫Mean daily temperature0-25 DPA25-50 DPA0-50 DPA5月11日 (T1)11-MayL-FB30.425.227.8M-FB28.824.626.7U-FB25.120.023.26月16日 (T2)16-JunL-FB25.120.023.2M-FB23.118.021.1U-FB21.516.719.6DPA：花后天數(shù)Days post anthes

18、is；L-FB: 下部果枝鈴Bolls setting on the lower fruiting branches；M-FB: 中部果枝鈴 Bolls setting on the middle fruiting branches；U-FB：上部果枝鈴 Bolls setting on the upper fruiting branches表2 試驗所用的PCR引物、退火溫度及循環(huán)數(shù)Table 2 Primers, Tm and Cycles of PCR used in the experiment基因及序列號Gene and accession number引物Primer退火溫度Tm

19、()循環(huán)數(shù)Cycles擴增片段長度 (bp)Length of amplified DNAExpansin（AF043284）forward：5-AGTCGAACCATAACCGTGACAGCC-3reverse：5-CCCAATTTCTGGACATAGGTAGCC-35623328-1,3-glucanase（D88416）forward：5-GAGGACATACAAAGCCTCGCA-3reverse：5-AGGTTGTAGTATTCCAAGCCT-35833455Sucrose（U73588）forward：5-AGAACCCAAAGTTGCGTGAG-3reverse：5-ACCGTT

20、ACAGGTTGCGAATG-35830305EF1（AJ223969）forward：5-AGACCACCAAGTACTACTGCAC-3reverse：5-CCACCAATCTTGTACACATGC-35526496RT-PCR所用各種生化酶均購自美國Promega公司，RNA提取過程中所需化學試劑均為分析純。2 結果與分析2.1 低溫對棉纖維加厚發(fā)育關鍵酶活性變化的影響在棉株的下部和中部果枝，T1播期鈴齡050 d日均溫（用T0-50d表示，下同）高于26，纖維加厚發(fā)育期，即花后2550 d（用T25-50d表示）日均溫在24左右，處于棉纖維加厚發(fā)育的適宜溫度13，而T2播期相應部位棉鈴

21、T0-50d在2123（T25-50d<21），可認為棉纖維加厚發(fā)育期處于低溫條件下13。從圖1看出，T1播期在不同鈴齡期的-1,3-葡聚糖酶活性均低于T2播期的相應指標，而蔗糖合成酶活性表現(xiàn)出與-1,3-葡聚糖酶活性相反的變化趨勢。在棉株上部果枝，T1、T2播期棉鈴T0-50d在1923（T25-50d均低于21，分別為20.0、16.7），棉纖維加厚發(fā)育期處于不同的低溫條件13，棉纖維中-1,3-葡聚糖酶活性均高于其相應播期的棉株下部和中部果枝鈴。T2播期在不同鈴齡期的-1,3-葡聚糖酶活性均高于T1播期，而蔗糖合成酶活性的變化趨勢則與此相反。低溫使-1,3-葡聚糖酶活性顯著提高，并

22、且隨鈴齡增大，酶活性變化率越大。低溫導致-1,3-葡聚糖酶活性的大幅度變化說明其比蔗糖合成酶對溫度變化更為敏感。2.2 低溫對棉纖維加厚發(fā)育關鍵酶基因表達的影響 Expansin（GhExp1） 從圖2看出，處于適宜溫度條件下時（T1播期），棉纖維加厚發(fā)育期棉株下部和中部果枝棉纖維中Expansin的表達量均表現(xiàn)為鈴齡15 d顯著高于7 d，到鈴齡25 d時不能檢測到該基因的表達，可能因為此時棉鈴處于發(fā)育最適期，鈴齡15 d時已進入Expansin表達高峰期附近，鈴齡25 d已幾乎不再表達。處于低溫條件下時（T2播期），Expansin表達規(guī)律與適宜溫度條件下的表達規(guī)律有較大差異：上部果枝棉纖

23、維中，Expansin在鈴齡7、15和25 d的表達量依次增加；在中部果枝鈴中則表現(xiàn)為鈴齡15 d時最高，7 d時次之，25 d最少；在下部果枝鈴中，鈴齡15 d時Expansin的表達量遠高于鈴齡7圖1 低溫對棉纖維發(fā)育關鍵酶活性變化的影響Fig. 1 Effect of low temperature on the dynamics of the key enzymes involved in the cotton fiber developmentL-FB：下部果枝鈴；M-FB：中部果枝鈴；U-FB：上部果枝鈴；EF1：參照基因。下同L-FB: Bolls setting on the

24、lower fruiting branches; M-FB: Bolls setting on the middle fruiting branches; U-FB: Bolls setting on the upper fruiting branches; EF1: a constitutive expression gene in cotton fiber. The same as below圖2 低溫對棉纖維中Expansin基因表達動態(tài)的影響Fig. 2 Effect of low temperature on the expression dynamics of the Expans

25、in gene in the cotton fiberd時，而至鈴齡25 d時則已幾乎不再表達。綜合分析T1、T2播期Expansin的表達量總體變化趨勢，表現(xiàn)為隨溫度降低，Expansin的表達量增加，而且在鈴齡15 d左右即纖維伸長與加厚發(fā)育的重疊期，低溫下Expansin到達表達峰值時間推后并且Expansin維持高表達的時間反而較常溫下有所加長。 -1,3-葡聚糖酶 從圖3看出，在棉株下部和中部果枝，棉鈴纖維加厚發(fā)育期處于適宜溫度條件（見2.1），鈴齡15 d棉纖維中-1,3-葡聚糖酶基因的表達量均顯著高于鈴齡7 d，鈴齡25 d時未能檢測到該基因的表達；在低溫條件下（見2.1），棉纖

26、維中-1,3- 圖3 低溫對棉纖維中-1,3葡聚糖酶基因表達動態(tài)的影響Fig. 3 Effect of low temperature on the expression dynamics of the -1,3-glucanase gene in the cotton fiber 葡聚糖酶基因的表達量均表現(xiàn)為鈴齡25 d15 d7 d。-1,3-葡聚糖酶基因的表達量隨溫度的降低而降低，這與2.1中關于-1,3-葡聚糖酶活性隨溫度的降低而升高的結論相反，原因可能是低溫條件下大量存在于質(zhì)外體空間的-1,3-葡聚糖酶的半衰期較長。在棉株上部果枝，T1、T2播期棉鈴纖維加厚發(fā)育期處于不同的低溫條件（

27、見2.1），鈴齡725 d內(nèi)-1,3-葡聚糖酶基因的表達均隨著鈴齡的增加而增加，不同低溫條件下基因表達量的變化趨勢相同。進一步分析鈴齡15 d時纖維中-1,3-葡聚糖酶基因表達量的變化，同樣是隨溫度降低而降低（圖4），不同果枝部位棉鈴表現(xiàn)相同趨勢。結合相應時期單位鮮重纖維所能提出的總RNA的量（表3），結果同時說明-1,3-葡聚糖酶基因的總表達量在纖維的伸長期基本維持在一個較穩(wěn)定的水平，但隨著纖維細胞生命活動的衰退，其表達量在單個發(fā)育中的纖維細胞中所占的比例逐漸上升，此結果進一步說明-1,3-葡聚糖酶在纖維的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。表3 單位鮮重棉纖維中總RNA量的定性比較Table 3 C

28、omparison of the total RNA content per unit freshweight in cotton fiber處理TreatmentRNA量 Total RNA content7 days15 days25 days常溫 Control+-低溫 Low temperature+圖4 低溫對棉纖維蔗糖合成酶基因表達動態(tài)的影響Fig. 4 Effect of low temperature on the expression dynamic of the sucrose synthetase gene in the cotton fiber 蔗糖合成酶 從圖4看出，

29、在棉株下部和中部的果枝，T1播期棉鈴纖維加厚發(fā)育期處于適宜溫度條件，鈴齡7 d纖維中蔗糖合成酶基因的表達量高于15 d，鈴齡25 d時未能檢測到該基因的表達；而T2播期的相應部位鈴則處于低溫條件，蔗糖合成酶基因表達量的變化趨勢均表現(xiàn)為鈴齡7 d15 d25 d；低溫下蔗糖合成酶基因的表達量略高于適宜溫度條件。在棉株上部果枝，T1、T2播期棉鈴纖維加厚發(fā)育期處于不同的低溫條件（見2.1），蔗糖合成酶基因表達量的變化趨勢也表現(xiàn)為鈴齡7 d15 d25 d。進一步分析鈴齡15 d時纖維中蔗糖合成酶基因表達量的變化，低溫導致鈴齡15 d時纖維中蔗糖合成酶基因表達量升高，不同果枝部位棉鈴表現(xiàn)相同趨勢。而

30、在相同的溫度條件下，不同果枝部位纖維蔗糖合成酶基因的表達量沒有明顯差異（圖5）。結合相應時期單位鮮重纖維的總RNA含量（表3），上述檢測結果表明，蔗糖合成酶基因的轉(zhuǎn)錄本在單個纖維細胞中所占的比例呈快速下降趨勢。2.3 低溫對棉纖維素累積量、纖維日伸長量和棉纖維比強度的影響圖5 棉株不同果枝部位棉鈴鈴齡15 d時纖維中Expansin、-1,3-glucanase及sucrose synthetase基因表達量比較Fig. 5 Comparison of expression of the Expansin, -1,3- glucanase and sucrose synthetase gene

31、s in cotton fiber at different fruiting branches at the 15 d boll age由圖6可知，在棉株的上、中、下部果枝，T1播期棉鈴纖維素累積量均高于T2播期，隨著鈴齡的增加，差距越來越大。隨著果枝部位的上升，纖維素累積含量受低溫的影響逐漸增大，且這種趨勢與相應溫度條件下的棉纖維的比強度（圖7）有很高的相關性。圖6 低溫對棉纖維素累積的影響Fig. 6 Effect of low temperature on cotton fiber cellulose accumulation以棉株中部果枝棉鈴纖維日伸長量為例，分析低溫對棉纖維日伸長量

32、的影響。從圖8可以看出，纖維加厚發(fā)育期處于適宜溫度時，棉纖維日伸長量在鈴齡14 d左右達到高峰，而低溫時棉纖維日伸長量在鈴齡17 d左右達到高峰，低溫使棉纖維伸長期延長，且伸長高峰推后。棉纖維日伸長速率前期表現(xiàn)為適溫高于低溫，而后期表現(xiàn)為低溫高于適溫。低溫下棉纖維伸長速率的這種變化與Expansin表達量的變化一致。圖7 低溫對棉纖維比強度的影響Fig. 7 Effect of low temperature on cotton fiber strength圖8 低溫對棉株中部果枝鈴棉纖維日伸長量的影響Fig. 8 Effect of low temperature on cotton fib

33、er daily elongationof the middle fruiting branches在棉株的上、中、下部果枝，T1播期棉鈴纖維比強度均高于T2播期（圖7）。隨著果枝部位的上升，纖維比強度受低溫的影響逐漸增大。3 討論棉花開花后15 d左右不僅是纖維伸長發(fā)育的高峰期，也是纖維加厚發(fā)育的關鍵時期。在鈴齡15 d附近，低溫與常溫條件下各纖維發(fā)育關鍵酶的活性變化及其相應基因表達量的變化最能體現(xiàn)低溫對纖維發(fā)育及纖維比強度的影響。在纖維主要伸長期（725 d），無論在常溫（T0-50d26，T25-50d在24左右）條件下，還是在低溫（T0-50d 1923，T25-50d21）條件下，E

34、xpansin于15 d左右達到表達高峰，這與纖維的伸長速率呈高度正相關。該結果進一步說明Expansin在纖維細胞的伸長過程中發(fā)揮著關鍵性的作用。結果同時說明，低溫條件下，纖維細胞中Expansin的表達到達峰值的時間推后且維持高表達的時間加長，這可能是因為低溫下纖維素合成速率顯著下降，纖維完成伸長所需的時間加長，細胞自身的反饋促進機制調(diào)節(jié)Expansin的表達從而使其維持高表達的時間延長。這也在一定程度上進一步縮短了低溫下纖維的加厚發(fā)育時間并進而降低了低溫條件下形成的纖維比強度。中部果枝棉鈴的高強度可能也與其纖維伸長發(fā)育的快速完成及較長的纖維加厚發(fā)育時間相關。隨著纖維發(fā)育的推移，單位鮮重-

35、1,3-葡聚糖酶的酶活下降，但該酶基因的表達量在整個細胞代謝過程中所占的比例卻不斷提高，其活性及表達量與纖維的伸長速率高度相關，該結果也在某種程度上說明在纖維伸長發(fā)育全過程中，-1,3-葡聚糖酶具有較高的表達量并可能在整個纖維發(fā)育過程中都具有很高的活性，是影響纖維發(fā)育及比強度形成的重要因子，但其在纖維發(fā)育過程中確切作用和詳細機制尚有待進一步的深入研究。蔗糖合成酶基因在纖維細胞中表達量隨鈴齡增加而下降，同時其表達受低溫誘導，溫度下降，表達量上升，上述結果說明蔗糖合成酶作為纖維發(fā)育過程中的重要酶7, 8，其對溫度及棉鈴生理年齡變化非常敏感。相應低溫條件下纖維的累積速率及纖維的比強度顯著低于常溫條件

36、，而作為纖維素合成底物UDPG的供應者，其在低溫及較高鈴齡條件下活性的快速降低可能是導致低溫下纖維素累積速率下降，進而降低纖維伸長速率和加厚速率，并最終導致纖維比強度極顯著下降的重要甚至關鍵性因素。蔗糖合成酶分為膜結合蔗糖合成酶及溶于胞質(zhì)的蔗糖合成酶。本研究未能對細胞中兩種形式的蔗糖合成酶的活性變化及基因表達進行細分研究，進一步研究可從細胞定位、酶基因編碼的多態(tài)性等角度將兩者分開，分別研究它們在纖維素合成中的表達及活性變化，為進一步闡述棉纖維中纖維素合成機理提供更充分依據(jù)。4 結論Expansin在棉纖維細胞中的表達量于鈴齡15 d左右達到高峰，但在低溫條件下，棉纖維細胞中Expansin的表

37、達到達峰值的時間推后且維持高表達的時間延長；-1,3-葡聚糖酶是影響棉纖維發(fā)育及比強度形成的重要因子，該酶的活性及基因表達量與棉纖維伸長速率高度相關；蔗糖合成酶基因在棉纖維細胞中表達量隨鈴齡增加而下降，作為棉纖維發(fā)育過程中的重要酶，其基因表達量對溫度及鈴齡變化非常敏感，溫度下降，表達量上升，蔗糖合成酶活性的下降可能是導致低溫下棉纖維素累積速率下降的關鍵因素。推測Expansin、-1,3-葡聚糖酶及蔗糖合成酶基因的協(xié)同表達可能在極大程度上決定棉纖維最終比強度。References1黃駿麒. 中國棉作學. 北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 1998: 237-239.Huang J Q. China

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