倍美力對去卵巢癡呆模型大鼠行為學及不同腦區(qū)膽堿乙酰轉移酶的干預作用

1、    倍美力對去卵巢癡呆模型大鼠行為學及不同腦區(qū)膽堿乙酰轉移酶的干預作用作者：安蓮華 柏玉萍 李貞蘭 張昱 趙珩 作者單位：吉林大學第一醫(yī)院老年病科，吉林 長春 130021【摘要】 目的 觀察去卵巢癡呆大鼠行為學及額葉皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)膽堿乙酰轉移酶(ChAT)的變化及倍美力對其影響，探討倍美力的腦保護機制。方法 采用穹窿海馬傘切除術及雙側卵巢切除制備癡呆及雌激素缺乏復合模型鼠，采用Morris水迷宮觀察其行為學變化，利用RTPCR法觀察大鼠額葉皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA的變化。結果 倍美力干預組大鼠學習、記憶能力增強，

2、額葉皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達增加(均P<0.01)。結論 倍美力可通過增加額葉皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達，改善模型鼠學習及記憶能力。【關鍵詞】 倍美力 老年性癡呆 膽堿乙酰轉移酶Effect of Premarin on praxiology and choline acetyltransferase in different cerebral regions of ovariectomized rats with dementiaAN LianHua, BAI YuPing, LI ZhenLan, et al.Department o

3、f Geriatrics, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, Jilin, China【Abstract】 Objective To observe the changes of praxiology and choline acetyltransferase (ChAT) in cerebral cortex, basal forebrain and hippocampi CA1 of rats after ovariectomized and transected hippocampal fimbriafor

4、nix and protective effect of premarin on brain. Methods The model of AD and ovariectomized (OVX) rats was established by transecting hippocampal fimbriafornix and OVX. Morris Water maze was used to test the ability of learning and memory function in each group. The expression of ChAT mRNA was measur

5、ed by RTPCR separately in different cerebral regions of rats. Results Premarin group had the enhanced ability of learning and memory function, the increased expressions of ChAT mRNA in different regions.Conclusions Premarin could increase the expression of ChAT mRNA in different cerebral regions of

6、rats and improve the ability of learning and memory function.【Key words】 Premarin;Alzheimer's disease(AD);Choline acetyltransferase流行病學調查表明，絕經后婦女阿爾茨海默病(AD)的發(fā)病率較同年齡組的男性高出1.53倍1，故推測雌激素的缺乏可能是導致AD發(fā)病的因素之一。神經生物化學研究顯示，AD患者基底前腦膽堿能神經元約有90%喪失，海馬和皮層錐體細胞的突觸及突觸煙堿受體、突觸前M型受體亦減少。AD患者乙酰膽堿(ACh)合成減少，膽堿乙酰轉移酶(ChAT)活

7、性下降，且與癡呆嚴重程度密切相關。本研究利用穹隆海馬傘切斷及去除雙側卵巢(OVX)較成功地模擬AD膽堿能神經元缺失及雌激素缺乏，建立雌激素缺乏及癡呆復合動物模型2，觀察倍美力對該模型大鼠行為學及額葉皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT的影響，為倍美力治療AD提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 動物分組與模型制備健康雌性Wister大鼠30只，鼠齡4個月，體重250300 g，由吉林大學基礎醫(yī)學部實驗動物中心提供。隨機分成對照組模型組倍美力組，每組各10只。模型組倍美力組：參照大鼠腦立體定位圖譜取前囟后2.2 mm，中線左右各旁開1.0 mm處，牙鉆鉆開顱骨，切開骨膜，用雙刃刀片(寬3.0 mm

8、，長30.0 mm)在上述部位的腦表面行冠狀切口，然后降刀4.5 mm，上下提抽刀20次，確保雙側海馬傘外側緣完全切斷，制備AD模型鼠。1 w后將上述10只鼠麻醉后切除雙側卵巢制備雌激素缺乏復合AD模型鼠;對照組：僅做顱骨鉆孔，不切斷海馬傘，僅切開腹腔，切除少量卵巢周圍脂肪。所有實驗動物術后常規(guī)喂養(yǎng)。卵巢切除術后2 w，倍美力組大鼠灌胃(按每天倍美力0.065 mg/kg，溶于1.5 ml生理鹽水中)，每日1次;模型組和對照組給與1.5 ml生理鹽水灌胃作對照，共8 w。其后對所有實驗動物做如下處理：Morris水迷宮測試4 d;第5天將大鼠斷頭處死，在冰上迅速剝離出額葉皮質基底前腦海馬，將分

9、離出的組織分別稱重后放入Epp管中，置入液氮中快速冷凍后放入-80冰箱中保存?zhèn)銹CR用。1.2 學習、記憶功能測定采用Morris水迷宮(中國醫(yī)學科學院藥物研究所)進行測試，歷時4 d。將大鼠面向池壁，分別從4個入水點放入池中，記錄大鼠尋找到平臺所需時間即為逃避潛伏期時間。定位航行實驗結束后撤掉平臺，將大鼠任選一入水點放入池中，測其2 min內跨越平臺所在位置的次數(shù)，記錄平均次數(shù)。1.3 RTPCR反應按標準Trizol法分別提取額葉皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)腦組織細胞總RNA，采用TaKaRa的二步法試劑盒說明書操作逆轉錄為cDNA后進行PCR。ChA T引物：上游：5CGTGGGCATG

10、CACATACTGTC3，下游：5CCCGTAAACCAGAAAGTAGGA3，擴增片段長度403 bp,反應體系40 l，ChAT變性94 30 s,退火55 30 s,延伸72 10 min,共30個循環(huán)。PCR產物以1.2%瓊脂糖電泳檢測，長波紫外燈下觀測照像，電泳結果以圖像分析系統(tǒng)進行電泳條帶光密度分析，計算產物ChAT與actin產物光密度積分的比值，作為ChAT mRNA的表達水平。1.4 統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，兩組間比較采用t檢驗。2 結 果2.1 Morris水迷宮實驗從表1中可見模型組大鼠逃避潛伏期時間明顯延長;

11、跨越平臺次數(shù)顯著減少，較對照組和倍美力組有明顯差異(P<0.01)，而對照組和倍美力組之間無明顯差異。表1 各組大鼠水迷宮學習、記憶成績比較(略)2.2 ChAT mRNA表達水平模型組大鼠大腦皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達水平明顯降低，與對照組有顯著差異(P<0.01);倍美力組不同腦區(qū)ChAT mRNA表達水平明顯提高，與模型組有顯著差異(P<0.01)，與對照組差異無統(tǒng)計學意義(見表2、圖1)。表2 各組大鼠不同腦區(qū)ChAT mRNA表達水平(略)3 討 論AD是與年齡相關的一種中樞神經系統(tǒng)慢性、進行性變性疾病，以認知障礙、老年斑(SP)、神經原纖維

12、纏結(NFT)顆?？张葑冃詾橹饕卣?。近年來，國內外學者為探討AD的發(fā)病機制和開發(fā)有效的藥物，相繼探討了一些模擬AD的動物模型及治療策略，但導致AD的關鍵機制尚不十分清楚，而建立與治療藥物存在因果關系的AD模型尤為重要。腦內膽堿能神經系統(tǒng)的損害是造成AD的重要原因之一4，膽堿能神經元分泌的神經遞質乙酰膽堿(ACh)是與認知功能密切相關的中樞神經遞質，ACh水平下降可導致動物的認知障礙和學習、記憶能力減退5。而Ach的產生釋放與傳遞是通過腦內中樞膽堿能神經系統(tǒng)實現(xiàn)的，該系統(tǒng)的膽堿能神經元胞體主要位于內側隔核(medial septum，MS)Broca斜角帶及Meynert基底核等，其投射纖維

13、到大腦新皮質海馬的廣泛區(qū)域6，這一投射系統(tǒng)與認知功能，學習、記憶能力密切相關，其任何一個環(huán)節(jié)被阻斷或損壞都可導致動物的認知障礙和學習記憶能力減退7，8。依據(jù)損壞方式的不同，可分為化學毀損、物理毀損、外科毀損等類型，其中雙側穹窿海馬傘切斷(hippocampal fimbriafornix，F(xiàn)F)因其方法簡單經濟有效，較廣泛地應用在藥物治療AD的研究中。Blusztajn等9研究證實：單側穹窿海馬傘切斷的動物存活12 w后，損傷同側MS膽堿能神經元較對側減少50%60%，斜角帶垂直支約減少40%。水迷宮測試該模型鼠的獲取能力和記憶能力明顯減低，表明該模型是一種較為理想的膽堿能神經系統(tǒng)損害模型。采

14、用雌激素替代治療(ERT)可以降低或延緩AD的發(fā)生10，11,提示認知水平的下降與雌激素水平降低有關，且雌激素可以改善認知水平。乙酰膽堿(Ach)是與認知功能密切相關的重要神經遞質之一12，腦脊液中Ach水平與癡呆程度呈負相關13,Ach代謝降低與動物認知障礙有關。Ach由ChAT催化合成，由AchE催化分解，通過Ach受體發(fā)揮其生物學效應。ChAT主要分布在突觸前神經末梢內，基底前腦的一些區(qū)域如MS和斜角帶垂直支、Meynert基底核的膽堿能系統(tǒng)能夠向大腦和海馬投射纖維，與學習、記憶有重要關系，故切斷FF后，可引起海馬膽堿能纖維缺失，動物則表現(xiàn)出認知功能減退，學習、記憶能力下降。ChAT是膽

15、堿能神經的標志酶，故常作為研究膽堿能神經的間接生物指標14。動物研究證實ERT可以逆轉癡呆模型鼠攝取膽堿量的減少，以及神經細胞中AchE數(shù)量的下降，阻止神經生長因子和腦源性神經生長因子的mRNA量的降低，提高大鼠大學習、記憶能力。雌激素在AD發(fā)病機制可能在于對膽堿能的調節(jié)15，其含量下降將導致膽固醇和磷脂轉運障礙，造成Ach合成不足，同時雌激素可促進基底前腦ChAT活性，通過上調膽堿能系統(tǒng)而減緩AD發(fā)展16。本實驗研究結果顯示，切斷雙側FF及OVX后，大鼠額葉皮質、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mRNA表達降低，學習、記憶能力下降，而補充倍美力后促進額葉、基底前腦、海馬CA1區(qū)ChAT mR

16、NA表達,從而改善了大鼠的學習、記憶能力，這一結果進一步證實了基底前腦膽堿能神經元投射到海馬的纖維通路及中樞膽堿能系統(tǒng)在AD病理機制中的重要地位，亦證實倍美力具有腦保護作用?！緟⒖嘉墨I】1 Halpern DF.Sex diferentes in cognitive abilitiesM.3rd ed.Hillsdale,NJ:Law rence Erlbaum Associates,2000:177.2 Singh M,Meyer EM,Millard WY,et al.Ovarian steroid deprivqtion results in a reversible learning

17、impairment and compromised cholinergic function in female SD ratsJ.Brain Res,1994;644:30512.3 王德生，張守信.老年癡呆M.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：609.4 Kasa P,Pakoncay Z,Gluya K.The cholinergic system in Alzheimers diseaseJ.Prog Neurobiol,1997;52:51136.5 吳 潔.Alzheimer病動物模型進展J.國外醫(yī)學老年醫(yī)學分冊，1998;19(1)：115.6 李月奎.Alzheimer病動物模

18、型進展J.中國神經免疫學和神經病學雜志， 1996;3(2)：11923.7 Kruqel U，Biql V，Eschrich K,et al.Deafferentation of the septohippocampal pathway in rats as a model of the metabolic events in Alzheimers diseaseJ.Int J Dev Neurosci,2001;19(3)：26377.8 張見影，王 哲.癡呆大鼠模型行為學、腦內膽堿乙酰轉移酶及突觸素的改變J.中國老年學雜志，2007;24(7)：65859.9 Blusztaji JK,Berse B.The cholinergic neuronal phenotype in Alzheimers diseaseJ.Metab Brain Dis,2000;15(1)：4564.10 Santiago P,Isabel C,Carman M.The central nervous system and HRTJ.Int J Fertil,2000;45(1)：1321.11 Gibbs RS.Impairment of basal forebrain cholinergic neurons associated with aging and longt