qPCR引物設計

1、qPCRqPCR引物設計引物設計Novobio Proprietary & Confidential應用類型應用類型 絕對定量（Absolute Quantification） 相對定量（Relative Quantification） microRNA研究（MicroRNA Research） 基因拷貝數(shù)變異（CNV Research） 基因分型/SNP分型（Gene Genotyping）1. Primer blast 1. Primer blast 引物設計及特異性檢驗工具引物設計及特異性檢驗工具Novobio Proprietary & Confidentialhttp

2、://tools/primer-blast/整合了Primer3軟件，再加上Blast進行引物特異性的驗證Primer blastPrimer blastNovobio Proprietary & Confidential輸入基因號輸入基因號或或FASTA序列序列定義引物的范圍定義引物的范圍（舉例：針對長3k的基因，若擴增1000-1050的范圍，則可填入Forward 1 to 1000, Reverse 1050 to 3000若有已知引物，可填入，以測試特異性針對sybr qPCR：產(chǎn)物大小填100 to 200（最大不超過300）可用默認

3、值（最佳Tm為60度，波動范圍57 to 63度，兩條引物Tm差值小于3度）Primer blastPrimer blastNovobio Proprietary & Confidential引物是否需跨不同引物是否需跨不同Exon選擇1 - 無所謂選擇2 - 必須跨不同Exon選擇3 - 可以不跨Exon勾選時表示兩條引物之間必須包括一個以上的勾選時表示兩條引物之間必須包括一個以上的Intron（當以基因組（當以基因組DNA為模板時）為模板時）基因組基因組DNADNA干擾的判別干擾的判別Novobio Proprietary & ConfidentialNo gDNA det

4、ected in the RT control (flat green/red line)Detection of contaminating gDNA in theRT control (dark blue line)no gDNA removal+RTRTNo templatecontrol+RTRT防止基因組防止基因組DNADNA污染的兩種引物設計方法污染的兩種引物設計方法Novobio Proprietary & ConfidentialAPrimer spans an intron/exon boundaryBPrimer flank an intronPrimer blas

5、tPrimer blastNovobio Proprietary & Confidential勾選時表示要檢測引勾選時表示要檢測引物的特異性物的特異性填入要比較的物種填入要比較的物種（可輸入通用名，如human/mouse/rat/rabbit當需要同時比較多物種時，點擊”Add more organisms”勾選勾選”show results in a new window”-點擊點擊”Get Primers”Primer blast Primer blast 結果結果Novobio Proprietary & Confidential基因的基因的Exon位置位置引物的位置引

6、物的位置Primer blast Primer blast 結果結果Novobio Proprietary & Confidential引物的基本情況引物和非相關產(chǎn)物的配對情況2. qP2. qPCRCR引物的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫引物的網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫Novobio Proprietary & ConfidentialPrimerBank is a public resource for PCR primers. These primers are designed for gene expression detection or quantification (real-time PCR).

7、 PrimerBank contains over 306,800 primers covering most known human and mouse genes./primerbank/PrimerBank PrimerBank 結果結果Novobio Proprietary & Confidential有些引物是附帶了驗證結果的Novobio Proprietary & ConfidentialmiRNART primerStep 1:Stem-loop RTStep 2:Real-time PCRcDNAForward

8、 primerReverseprimerFQTaqMan probe成分：成分：1. 莖環(huán)莖環(huán)RT引物引物2. 正向引物正向引物3. 反向引物（通用）反向引物（通用）4. TaqMan探針（可選）探針（可選）3. miRNA qPCR的引物設計（莖環(huán)引物法）的引物設計（莖環(huán)引物法）Novobio Proprietary & ConfidentialmiRNA miRNA qPCRqPCR引物數(shù)據(jù)庫引物數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)庫來源：MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells，http:/www.ncbi.nlm

9、./pmc/articles/PMC1351374/Novobio Proprietary & Confidential以以has-miR-16為例：為例：成熟miRNA序列（末端8個堿基用下劃線標注）has-miR-16：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG1）RT引物（注：5端為通用的Stem和 Loop序列，末位8個堿基和miRNA末端序列互補）CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA2）Forward primer（注：下劃線標記的部分和免去末端6個堿基的靶miRNA序列同源）ACACTCCAGCTGGGTA

10、GCAGCACGTAAATA3）Reverse primer（注：序列固定）TGGTGTCGTGGAGTCG4）Taqman MGB探針（下劃線標記部分與miRNA末端序列互補）(6-FAM) TTC AGT TGAG CGCC AATA(MGB)miRNA qPCR的引物設計的引物設計Novobio Proprietary & Confidential內參U6（Human/Mouse/Rat）的引物CTCGCTTCGGCAGCACAAACGCTTCACGAATTTGCGT注：U6不屬于miRNAmiRNA qPCR的的內參引物內參引物附錄附錄1 1 - - 染料法引物的設計原則染料法

11、引物的設計原則Novobio Proprietary & Confidential（1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續(xù)配對，避免引物 自身形成環(huán)狀發(fā)卡結構；（3）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯 子；（4）、引物之間的TM相差避免超過2；（5）、典型的引物18到24個核苷長；（6）、目的基因和內參基因所擴增的PCR產(chǎn)物長度盡量一致，不大于 300bp，這樣有利于使兩種基因PCR效率相同（7）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做BLAST分析其 特異性附錄附錄2 - 2 - T

12、aqmanTaqman探針及引物的設計原則探針及引物的設計原則Novobio Proprietary & Confidential（1）、序列選取應在基因的保守區(qū)段，不能有堿基變異；（2）、檢測mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯 子；（3）、引物TM值為60左右，探針的TM值為70左右（確保探針先于引物與模板結合，這就要求探針的TM值高于引物10左右）；（4）、探針的5端應避免使用鳥嘌呤G，因為5G會有淬滅作用，而且即使 是被切割下來還會存在淬滅作用； （5）、整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量 G含量高會降低反應 效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針

13、； （6）、引物之間的TM相差避免超過2；（7）、典型的引物長度為18-24bp，探針長度為15-45bp；（8）、PCR產(chǎn)物長度在50-150bp之間，這樣有利于使PCR效率相同；（9）、將設計好的引物用序列分析軟件分析其二級結構并做BLAST分析其 特異性 附錄附錄3 - Taqman3 - Taqman探針合成時注意事項探針合成時注意事項Novobio Proprietary & Confidential（1）引物及探針設計好之后，委托一家放心的合成公司合成；（2）先不要急于合成探針，先引物合成，引物合成好以后，做普通 PCR，電泳檢測PCR產(chǎn)物，看是否和設計的長度吻合，再看看非

14、特異 性擴增情況，必要時進行PCR產(chǎn)物的測序驗證；（3）確定引物沒有問題后，再將探針送交合成，這樣安排能避免很多以 外的損失；（4）探針合成好后，先檢測一下探針的質量，250nm的探針終濃度， 25ul水，反應體系中只有水和探針，在熒光定量PCR儀上檢測， 95，2min; 95，20s，60，20s，40個cycles；看熒光本底和 熒光強度的變化情況，好的探針熒光本底較低，隨著PCR反應，熒 光強度不會變化，假如熒光強度變化的比較大，說明探針合成質量 較差，建議重新合成。附錄附錄4 - 4 - 逆轉錄方法的選擇逆轉錄方法的選擇Novobio Proprietary & Confid

15、ential逆轉錄方式逆轉錄方式 1-step (one tube) RT-PCR1-step (one tube) RT-PCR（病毒檢測） cDNA合成與PCR同管進行 快速、更少污染 對于稍微有些降解的RNA檢測靈敏度更高 2-step RT-PCR2-step RT-PCR（基因水平變化） 一次cDNA可用于多次PCR附錄附錄5 5 - - RTRT引物的選用引物的選用 GSP：常用于一步法RTPCR。但是引物設計質量影響RT的結果。在擴增低豐度的轉錄本時是最好的。 Oligo dT引物:真核生物的mRNA適用，建議用于高質量RNA及全長轉錄本的逆轉錄；不適用于降解的RNA 隨機引物：

16、適合各種RNA的RT，可用于mRNA片段的逆轉錄。2-step Real-time RT-PCR2-step Real-time RT-PCR的逆轉錄引物選擇的逆轉錄引物選擇Novobio Proprietary & ConfidentialAmplicon 3-end: 2 kb(N)9 Oligo-dT+(N)9Oligo-dTAmplicon 3-end: 6 kbOligo-dT Oligo-dT+(N)9(N)9(A)n使用Oligo-dT作為引物：擴增離3端遠近不同的片段，離3越遠擴增越差必須使用Oligo-dT+(N)9附錄附錄6 6 qPCR qPCR引物的驗證結果示意引物的驗證結果