淺談蘇木乙醇提取物對(duì)坐骨神經(jīng)損傷小鼠免疫功能的積極作用

1、淺談蘇木乙醇提取物對(duì)坐骨神經(jīng)損傷小鼠免疫功能的積極作用         【摘要】研究蘇木乙醇提取物（SME）對(duì)坐骨神經(jīng)損傷小鼠免疫功能的影響。方法 選取成年雄性Balb/c小鼠60只，隨機(jī)分為SME高中低劑量組和空白對(duì)照組，行右側(cè)坐骨神經(jīng)離斷吻合術(shù)，分別于術(shù)后3、5、7、14、28 d以MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力，ELISA法測(cè)定血清循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）濃度。結(jié)果 各時(shí)間點(diǎn)小鼠淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化能力及血清CIC濃度與SME劑量呈明確的量效關(guān)系。結(jié)論 SME能夠影響坐骨神經(jīng)損傷小鼠的細(xì)胞及體液免疫功能，且與用

2、藥劑量存在明確量效關(guān)系。 【論文關(guān)鍵詞】蘇木乙醇提取物；神經(jīng)損傷；免疫在以往對(duì)活血化瘀類中藥進(jìn)行的免疫活性篩選中，蘇木顯示出超眾的免疫抑制效用1，有報(bào)道證實(shí)蘇木乙醇提取物對(duì)大鼠淋巴細(xì)胞活性有顯著抑制作用2。諸多相關(guān)研究顯示周圍神經(jīng)損傷后，損傷局部發(fā)生的免疫反應(yīng)對(duì)神經(jīng)再生起抑制作用，免疫反應(yīng)越強(qiáng)，神經(jīng)纖維再生和功能恢復(fù)越差，抑制神經(jīng)損傷觸發(fā)的免疫反應(yīng)對(duì)神經(jīng)再生起促進(jìn)作用3。本文擬通過(guò)對(duì)離體免疫細(xì)胞活性及血清循環(huán)免疫復(fù)合物（CIC）的測(cè)定，研究蘇木乙醇提取物對(duì)坐骨神經(jīng)損傷Balb/c小鼠免疫功能的影響，為蘇木于促進(jìn)周圍神經(jīng)再生尋找理論依據(jù)。1  材料與方法1.1  動(dòng)物與試劑

3、健康雄性Balb/c小鼠60只，體重1822 g（吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），隨機(jī)分為蘇木醇提物高、中、低(16、8、4 g·kg-1·d-1)劑量組及生理鹽水對(duì)照組。各按術(shù)后3、5、7、14、28 d分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)12只。主要試劑：蘇木乙醇提取物購(gòu)自陜西昌岳植化技術(shù)公司，刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)、MTT粉購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清（FBS）購(gòu)自杭州四季青公司，小鼠CIC酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自Rapidbio公司，RPMI1640購(gòu)自Gibco公司。1.2  模型制備與給藥 1%硫噴妥鈉100 mg/kg腹腔麻醉小鼠，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，做右側(cè)臀

4、部斜行切口，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)。在坐骨結(jié)節(jié)下0.5 cm處完全切斷神經(jīng)干，12倍手術(shù)顯微鏡下將斷端對(duì)位后以90無(wú)損傷線吻合斷端兩針，逐層閉合創(chuàng)口。給藥方法和劑量：采取灌胃方法給藥。參照應(yīng)用蘇木原藥劑量，等效換算為小鼠灌胃用劑量4，將此數(shù)值作為給藥的中等劑量，并以等比數(shù)列量確定高低劑量組用量。連續(xù)給藥14 d。1.3  淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定ConA最適終濃度為5 g/ml，LPS最適終濃度為40 g/ml。按時(shí)間點(diǎn)順序，每組取小鼠3只，眼球取血約0.5 ml后斷頸處死，無(wú)菌取脾，置入含RPMI1640的平皿中，研磨吹打均勻后，200目鋼絲網(wǎng)過(guò)濾吸取細(xì)胞懸液。以RPM

5、I1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml，加入微孔培養(yǎng)板，每孔0.1 ml。20%FBS（FBSRPMI1640=14）調(diào)整ConA濃度為10 g/ml，LPS濃度為80 g/ml。每個(gè)樣品各加3復(fù)孔，每孔加入ConA/LPS 0.1 ml，設(shè)對(duì)照3復(fù)孔，每孔加入20%FBS 0.1 ml。37 CO2孵育箱培養(yǎng)44 h，加入MTT（5 mg/ml）20 l/孔，繼續(xù)孵育4 h。小心吸去上清，加入DMSO原液100 l/孔，震蕩器震蕩10 min。酶標(biāo)儀上讀出結(jié)果（OD570 nm）。結(jié)果判定，刺激指數(shù)SI=藥物刺激孔OD均值/對(duì)照組OD均值。1.4  ELISA法測(cè)

6、定小鼠CIC 將1.3中所取血液于無(wú)菌EP管中常溫靜置2 h后4冰箱過(guò)夜，次日5 000 r/min離心3 min，取上層血清，儲(chǔ)存于-20冰箱備用，待所有動(dòng)物取材完畢后同時(shí)進(jìn)行ELISA測(cè)定。方法嚴(yán)格遵照試劑盒說(shuō)明書。1.5  學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行組間t檢驗(yàn)。         2  結(jié)果2.1  各時(shí)間點(diǎn)小鼠T/B淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化結(jié)果 除術(shù)后3 d低劑量組外，其余各時(shí)間點(diǎn)各劑量組與對(duì)照組間均存在顯著差異(P0.05,P0.01,P0.001)，且依劑量由低到高顯著性呈遞增

7、趨勢(shì)。見表1。表1  術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)小鼠T/B淋巴細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)化結(jié)果(略)2.2  各時(shí)間點(diǎn)小鼠CIC酶聯(lián)免疫分析 血清CIC濃度在術(shù)后514 d呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，至術(shù)后28 d基本恢復(fù)如常。各時(shí)間點(diǎn)各劑量組與對(duì)照組之間的差異性與用藥劑量存在明確的量效對(duì)應(yīng)關(guān)系。見表2和1。表2  各時(shí)間點(diǎn)小鼠CIC濃度對(duì)比結(jié)果(略)3  討論上世紀(jì)80年代之前，由于血神經(jīng)屏障的存在，神經(jīng)一直被認(rèn)為是免疫豁免區(qū)。然而隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)了鼠坐骨神經(jīng)損傷之后血液中出現(xiàn)的抗神經(jīng)節(jié)苷脂抗體和髓鞘自身抗體以及損傷后神經(jīng)周圍大量的T淋巴細(xì)胞聚集5，證明神經(jīng)損傷后體液和細(xì)胞免疫都會(huì)產(chǎn)生變

8、化。之后進(jìn)一步明確了這些局部的免疫反應(yīng)對(duì)神經(jīng)再生的抑制作用6。在此研究基礎(chǔ)上，近年來(lái)學(xué)者做出了一些免疫抑制劑促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的嘗試，其中有關(guān)FK506等藥物的研究顯現(xiàn)出可喜的前景7。FK506作為天然菌類的提取物，其良好效用的背后是高昂的造價(jià)。在廣博的中藥海洋中，能否尋找一種作用類似FK506且造價(jià)較低的促神經(jīng)再生藥物呢？蘇木(Caesalpinia sappan L)，豆科云實(shí)屬，主要分布于印度、緬甸、越南境內(nèi)，藥用部位為其干燥心材，又名蘇方木、赤木等。蘇木乙醇提取物的主要成分為氧化巴西木素、巴西木素、十八酸、豆甾醇等九種化合物8，有關(guān)實(shí)驗(yàn)證明上述成分起主要免疫抑制作用的是氧化巴西木素9。本

9、研究結(jié)果顯示，蘇木乙醇提取物對(duì)坐骨神經(jīng)損傷小鼠免疫功能產(chǎn)生了抑制作用，且存在明顯的量效關(guān)系。為開發(fā)蘇木乙醇提取物促進(jìn)神經(jīng)再生的潛能打下了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 楊 鋒,沈 翔,胡利平,等.活血化瘀中藥對(duì)免疫活性細(xì)胞調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究J.中國(guó)實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)雜志,1993；5(1):37.2 于 波,侯靜波,呂 航,等.蘇木有效成分對(duì)大鼠免疫活性細(xì)胞的影響J.中國(guó)急救,2002；22(4):1879.3 Shu SH,Zhang L,Du GH,et al.Study on the chemical constituents of Caesalpinia sappanJ.Nat Pro

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