wb原理步驟及總結(jié)

1、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)印跡是把電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上，然后利用抗原抗體反應(yīng)來檢測特異性的蛋白分子的技術(shù)，包括三個(gè)部分：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白質(zhì)的電泳轉(zhuǎn)移，免疫印跡分析。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳主要用于測定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量，SDS是陰離子去污劑，能斷裂蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞其高級(jí)結(jié)構(gòu)。SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4:1,由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合時(shí)掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，使各種蛋白質(zhì)帶有相同密度的負(fù)電荷， 形似長橢圓棒， 蛋白遷移率與蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。 因此，利用相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求

2、得未知蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量。電泳后蛋白質(zhì)分子嵌在凝膠介質(zhì)中，探針分子很難通過凝膠孔，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固定基質(zhì)上可以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫檢測分析。 方法有兩種： 水平半干式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)似三明治樣夾在緩沖液浸濕的濾紙中間，通電1030min可完成垂直濕式轉(zhuǎn)移即將凝膠和固定基質(zhì)夾在濾紙中間， 浸在轉(zhuǎn)移裝置的緩沖液中， 通電24h或過夜可完成。 固定基質(zhì)通常有硝酸纖維素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龍膜。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固定化膜上之后，通過蛋白質(zhì)染料如麗春紅S檢測膜上的總蛋白，或用考馬斯亮藍(lán)檢測凝膠上的蛋白剩余量，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)移是否成功。用抗體作為探針進(jìn)行特異性的免疫反應(yīng)檢測抗原蛋白，分為4步：用非特異性、非

3、反應(yīng)活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由結(jié)合區(qū)，以防止作為探針的抗體結(jié)合到膜上，出現(xiàn)檢測時(shí)的高背景固定化膜用專一性的一抗溫育，使一抗與膜上的抗原蛋白分子特異性結(jié)合酶標(biāo)二抗與一抗特異結(jié)合加入酶底物，適當(dāng)保溫，膜上便可見到顏色反應(yīng)，檢測出抗原蛋白區(qū)帶。主要溶液10附離膠水3.3mL、30%丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/LTris(pH8.8)2.5mL、10%SDS0.1mL10%S硫酸錢0.1mLTEMED0.004mL5%$縮膠水2.7mL、30%5烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%t硫酸錢0.04mLTEMED0.004

4、mL1 xTris-甘氨酸電泳緩沖液Tris堿3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g,用去離子水定容至1L2XSDSS膠加樣緩沖液Tris-HCl(pH6.8)100mmol/L,0-琉基乙醇10%10%T油，0.01%M酚藍(lán)，10%SDS轉(zhuǎn)移緩沖液Tris2.45g,甘氨酸11.25g,甲醇100mL加去離子水至1LTBSTTris1.21gNaCl8.77g,Tween-201mL加去離子水至1LStripping1.3mLTris(pH6.8),4mL10%SDS140小甲-琉基乙醇，用水定容到20mL實(shí)驗(yàn)步驟1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠配置分離膠的配置：將配置好的分離膠液混勻

5、后迅速倒入膠槽中，至距離短玻璃板頂端約2cm處，停止灌膠。檢查是否有氣泡，若有用濾紙條吸出。然后在膠液界面上加蒸儲(chǔ)水進(jìn)行水封。1530min后，凝膠和水封層界面清晰，說明膠已經(jīng)聚合完全，然后用濾紙吸取水封層，濾紙切勿接觸到凝膠面。(使蛋白樣品分離)濃縮膠的配置：將配置好的濃縮膠灌注在分離膠之上，直至短玻璃板的頂端，然后插入樣品槽梳子。室溫下濃縮膠聚合，約2030min。（使蛋白樣品濃縮）蛋白樣品的處理將蛋白樣品溶于樣品溶解液，終濃度為0.51mg/ml。然后轉(zhuǎn)移到小離心管中，輕輕蓋上蓋子（不能塞緊，以免加熱時(shí)液體迸出），在100c沸水浴中加熱3min,取出冷卻后備用，使用前需要將樣品離心除去顆

6、粒物質(zhì)。暫時(shí)用不到的話，可放在-20c冰箱長期保存，使用時(shí)沸水浴中加熱3min,以除去亞穩(wěn)聚合態(tài)物質(zhì)。上樣前的樣品一定要均勻以防電泳時(shí)出現(xiàn)縱向條帶。加樣拔去樣品槽梳子，倒入電極緩沖液，沒過短板約0.5cm以上，若樣品槽中有氣泡，用槍頭挑除。按順序向凝膠樣品槽中加入標(biāo)準(zhǔn)蛋白和未知蛋白樣品，每孔的加樣量要相同，一般加樣體積為1030仙1,加樣時(shí)槍頭深入到加樣槽內(nèi)，盡量接近底部，記錄加樣順序。電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開直流穩(wěn)壓電源，先80V過了濃縮膠后改為120V,待澳酚藍(lán)指示劑遷移到凝膠下沿1cm時(shí)停止電泳。2蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移水平半干式電轉(zhuǎn)移戴乳膠手套剪濾紙6張，濾紙長與寬比SDS-PAGE交

7、各大1cm,裁剪與SDS-PAGE交長寬相等的Nd。將3張濾紙和SDS-PAGE交浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中待用。將另3張濾紙和NC專移膜浸在正極轉(zhuǎn)移液中待用。將浸在負(fù)極轉(zhuǎn)移液中的濾紙取出，盡量少帶液體，置于轉(zhuǎn)移槽負(fù)極上，然后在負(fù)極濾紙上依次鋪放SDS-PAGE交、NQ1、3張用正極轉(zhuǎn)移液飽和的濾紙。注意排除氣泡，因?yàn)闅馀輹?huì)產(chǎn)生高阻抗點(diǎn)，形成低效印跡區(qū)，即所謂“禿斑”。蓋上石墨陽極板，設(shè)定50mAB流，轉(zhuǎn)移一定時(shí)間。垂直濕式轉(zhuǎn)移凝膠片的平衡： 把電泳后的凝膠從玻璃板上轉(zhuǎn)移至成有適量轉(zhuǎn)移緩沖液的大培養(yǎng)皿中， 浸泡3060min,以除去膠中的SDS使其pH及離子強(qiáng)度和印跡緩沖液相一致，防止凝膠發(fā)生膨脹或皺縮

8、。將轉(zhuǎn)移緩沖液冷卻至4c準(zhǔn)備NC膜和濾紙：戴乳膠手套裁剪與凝膠大小相同的NC膜和4張濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸潤膜和濾紙15min,直到?jīng)]有氣泡，將海綿在轉(zhuǎn)移緩沖液中充分浸濕打開蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移槽的轉(zhuǎn)移夾，依次放入：浸濕的海綿，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，用轉(zhuǎn)移緩沖液浸過的膠，NC膜，兩張用轉(zhuǎn)移緩沖液飽和的濾紙，浸濕的海綿，然后合上轉(zhuǎn)移夾。轉(zhuǎn)移槽中倒入轉(zhuǎn)移緩沖液，然后將轉(zhuǎn)移夾置于槽中，凝膠靠近負(fù)極NC膜靠近正極將轉(zhuǎn)移槽放到4c冰箱內(nèi)，電轉(zhuǎn)移，恒流80mA4h03免疫印跡分析NC膜上總蛋白的染色和脫色：將電泳轉(zhuǎn)移完后的NC膜取出，置于培養(yǎng)皿中。麗春紅S染色3min后，用鉛筆輕輕標(biāo)出標(biāo)準(zhǔn)蛋白帶的位置以備計(jì)算特

9、異性蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量所需。然后，用麗春紅S脫色液輕輕漂洗數(shù)次至紅色消失。特異性抗體檢測脫色后的NC膜置于培養(yǎng)皿中，加入封閉液，并在水平搖床上不斷振搖，室溫下封閉2h以上。（將膜上未結(jié)合目的蛋白的區(qū)域封閉以防止一抗的結(jié)合）倒出封閉液，加入漂洗液，水平搖床上不斷振搖，洗膜3次，每次5min。（除去封閉漂洗完后，將膜轉(zhuǎn)移至雜交袋中，加入特異性一抗，與目的抗原蛋白特異性結(jié)合）液）4c搖床過夜或室溫放搖3h（一抗利用水平搖床，用TBST光月M3次，每次5min。（洗去未結(jié)合的一抗）將膜轉(zhuǎn)移到稀釋的酶標(biāo)二抗中，在室溫下孵育30min傾去二抗，用TBST洗膜，室溫?fù)u洗三次，每次5min,蛋白面朝上，置于保

10、鮮膜中，將ECL的A液和B液以1:1體積混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/cm2的量滴加于膜表面，孵育1min,濾紙吸去多余液體用保鮮膜包好，立即于暗室內(nèi)曝光數(shù)秒。在暗室中，將1X顯影液和定影液分別到入塑料盤中。在紅燈下取出X光片，剪裁適當(dāng)大?。ū饶さ拈L和寬均需大1cm）。打開X-光片夾，把X光片放在膜上，一旦放上，便不能移動(dòng)，關(guān)上X-光片夾，開始計(jì)時(shí)。根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)弱適當(dāng)調(diào)整曝光時(shí)間，一般為1min或5min,曝光完成后，打開X-光片夾，取出X-光片，迅速浸入顯影液中顯影，待出現(xiàn)明顯條帶后，即刻終止顯影。顯影時(shí)間一般為12min（2025C）,溫度過低時(shí)（低于16C）需適當(dāng)延長顯影時(shí)間。

11、顯影結(jié)束后，馬上把X-光片浸入定影液中，定影時(shí)間一般為510min,以膠片透明為止。用自來水沖去殘留的定影液后，室溫下晾干。注意事項(xiàng)在合適的鹽濃度下，應(yīng)保持蛋白質(zhì)的最大溶解性和可重復(fù)性。不同濃度的凝膠用于分離不同相對(duì)分子質(zhì)量的蛋白選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和共價(jià)鍵、二硫鍵。對(duì)于多亞基蛋白或含多條肽鏈的蛋白，SDS-PAGE只能測定它們的亞基或單條肽鏈的相對(duì)分子質(zhì)量。盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子。蛋白質(zhì)樣品在處理過程中應(yīng)低溫下進(jìn)行，以避免細(xì)胞破碎釋放出各種酶對(duì)其進(jìn)行修飾盡量使用新鮮的loadingbuffer,樣品要與loadingbuffer混合均勻，

12、不可將蛋白質(zhì)反復(fù)凍融使用以防改變蛋白質(zhì)的抗原特性，Buffer一定要漫過梳子孔，否則可能會(huì)發(fā)現(xiàn)蛋白跑不動(dòng)。電泳時(shí)先用低電壓跑過濃縮膠，再換高電壓跑分離膠，特別是對(duì)于高分子量的目的蛋I硝酸纖維素（NC）膜：NC與蛋白質(zhì)靠疏水作用結(jié)合，無需預(yù)先活化，對(duì)蛋白質(zhì)的活性影響小。非特異性本底顯色淺。價(jià)格低廉，使用方便。但結(jié)合在NC上的小分子蛋白質(zhì)在洗滌時(shí)易丟失。NC韌性較差，易損壞。聚偏二氟乙烯（PVDF）膜：與蛋白質(zhì)親和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。但價(jià)格上稍貴。為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小要先將膜晾干，然后浸入20%勺甲醇，待完

13、全浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（適用于PVDF膜）。傳統(tǒng)方法是將膜用1X麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖），然后用水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。從轉(zhuǎn)股完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。高背景可能的原因：膜未均勻浸泡。膜或緩沖液污染。封閉不充分。抗體與封閉液出現(xiàn)交叉反應(yīng)?？贵w濃度過高。解決方法有：轉(zhuǎn)膜前用100刈醇將膜完全浸泡。雜交前檢測一抗、二抗。檢測一抗、二抗與封閉液是否有交叉反應(yīng)。轉(zhuǎn)股的效果可以觀察所使用的預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，通常分子量最大的1-2條帶較難全部轉(zhuǎn)到膜上。轉(zhuǎn)膜的效果也可以用麗春紅染色液對(duì)膜進(jìn)行染色，以觀察實(shí)際的轉(zhuǎn)

14、膜效果。也可以用考馬斯亮藍(lán)快速染色液對(duì)完成轉(zhuǎn)膜的SDS-PAG膠進(jìn)行染色，以觀察蛋白的殘留情況。作用定性分析蛋白質(zhì)，特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測和測定蛋白質(zhì)分子量，分析目的蛋白表達(dá)的特異性。蛋白樣品的制備（1）單層貼壁細(xì)胞總蛋白的提取：1、倒掉培養(yǎng)液，并將瓶倒扣在吸水紙上使吸水紙吸干培養(yǎng)液（或?qū)⑵恐绷⒎胖靡粫?huì)兒使殘余培養(yǎng)液流到瓶底然后再用移液器將其吸走）。2、每瓶細(xì)胞加3ml4c預(yù)冷的PBS（0.01MpH7.27.3）。平放輕輕搖動(dòng)1min洗滌細(xì)胞，然后棄去洗液。重復(fù)以上操作兩次，共洗細(xì)胞三次以洗去培養(yǎng)液。將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10口PMSF（100mM,搖勻置于冰

15、上。（PMSF要搖勻至無結(jié)晶時(shí)才可與裂解液混合。）4、每瓶細(xì)胞加400口含PMSF勺裂解液，于冰上裂解30min,為使細(xì)胞充分裂解培養(yǎng)瓶要經(jīng)常來回?fù)u動(dòng)。5、裂解完后，用干凈的刮棒將細(xì)胞刮于培養(yǎng)瓶的一側(cè)（動(dòng)作要快），然后用槍將細(xì)胞碎片和裂解液移至1.5ml離心管中。（整個(gè)操作盡量在冰上進(jìn)行。）6、于4c下12000rpm離心5min。（提前開離心機(jī)預(yù)冷）7、將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到離心管中放于20c保存。（2）組織中總蛋白的提?。?、將少量組織塊置于12ml勻漿器中球狀部位，用干凈的剪刀將組織塊盡量剪碎。2、加400/單去污劑裂解液裂（含PMSF于勻漿器中，進(jìn)行勻漿。然后置于冰上。3、幾分鐘后再

16、碾一會(huì)兒再置于冰上，要重復(fù)碾幾次使組織盡量碾碎。4、裂解30min后，即可用移液器將裂解液移至1.5ml離心管中，然后在4c下12000rpm離心5min,取上滿分裝于0.5ml離心管中并置于一20c保存。（3）加藥物處理的貼壁細(xì)胞總蛋白的提?。河捎谑芩幬锏挠绊懀恍┘?xì)胞脫落下來，除了按（一）操作外還應(yīng)收集培養(yǎng)液中的細(xì)胞。培養(yǎng)液中細(xì)胞總蛋白的提取：1、將培養(yǎng)液倒至15ml離心管中，于2500rpm離心5min。2、棄上清，加入4mlPBS并用槍輕輕吹打洗滌，然后2500rpm離心5min。棄上清后用PBS重復(fù)洗滌一次。3、用槍洗干上清后，加100口裂解液（含PMSF冰上裂解30min,裂解過程

17、中要經(jīng)常彈一彈以使細(xì)胞充分裂解。4、將裂解液與培養(yǎng)瓶中裂解液混在一起4C、12000rpm離心5min,取上滿分裝于0.5ml離心管中并置于20c保存。（三）蛋白含量的測定（1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1、從20C取出1mg/mlBSA,室溫融化后，備用。2、取18個(gè)1.5ml離心管,3個(gè)一組，分別標(biāo)記為0mg,2.5mg,5.0mg,10.0mg,20.0mg,40.0mg。3、按下表在各管中加入各種試劑010.0mg20.0mg40.0mgmg2.5mg5.0mg1mg/mlBSA一2.5ml5.0ml10.0ml20.0ml40.0ml0.15mol/LNaCl100ml97.5ml95.0ml90

18、.0ml80.0ml60.0mlG250考馬斯亮藍(lán)溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4、混勻后，室溫放置2min。在生物分光光度計(jì)上比色分析。（2）檢測樣品蛋白含量1、 取若干1.5ml離心管， 每管加入4c儲(chǔ)存的考馬斯亮藍(lán)溶液1ml。 室溫放置30min后即可用于測蛋白。2、 取一管考馬斯亮藍(lán)加0.15mol/LNaCl溶液100ml,混勻放置2分鐘可做為空白樣品， 將空白倒入比色杯中在做好標(biāo)準(zhǔn)曲線的程序下按blank測空白樣品。3、棄空白樣品，用無水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5ml）,再用無菌水洗一次。4、取一管考馬斯亮藍(lán)加95ml0.15mol/LNaClNaCl溶液和5ml待測蛋白樣品， 混勻后靜置2min,倒入扣干的比色杯中按sample鍵測樣品。注意：每測一個(gè)樣品都要將比色杯用無水乙醇洗2次，無菌水洗一次?？赏瑫r(shí)混合好多個(gè)樣品再一起測，這樣對(duì)測定大量的蛋白樣品可節(jié)省很多時(shí)間。測得的結(jié)果是5ml樣品含的蛋白量。主要參考生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教程劉箭主編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)魏群主編還有百度上搜的關(guān)于wb的方法步驟及試驗(yàn)中出現(xiàn)的問題熱致相分離法的英文縮寫TIPS,是ThermallyIn