樹突狀細(xì)胞疫苗在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

1、樹突狀細(xì)胞疫苗在腫瘤免疫治療領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀潘春華綜述羅榮城審校(第一軍醫(yī)大學(xué)附屬南方醫(yī)院腫瘤科,廣州510515中國(guó)圖書分類號(hào)R73013文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)10002484X(20031020732204樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells,DC是目前所知的功能最強(qiáng)的、也是唯一能激活初始性T細(xì)胞(Native T cell的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigen Presenting Cell, APC,具有強(qiáng)大的激活C D8+CT L及C D4+T輔助細(xì)胞的能力,控制著體內(nèi)免疫反應(yīng)的過(guò)程,在免疫應(yīng)答中處于中心地位,因而成為腫瘤免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)。DC可以在體外培養(yǎng)后用于體內(nèi)免疫治療,也可輔

2、以細(xì)胞因子或其它因子如Flt23等在體內(nèi)擴(kuò)增1。用DC疫苗進(jìn)行抗腫瘤治療已受到重視2,3,且成為當(dāng)今腫瘤生物治療領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)課題,對(duì)樹突狀細(xì)胞疫苗的研究日趨深入而廣泛。1樹突狀細(xì)胞及其生物學(xué)特征DC最初是Steinman和C ohn等1973年從小鼠的脾組織中分離發(fā)現(xiàn)的,因其形態(tài)具有樹突樣或偽足樣突起而命名。DC細(xì)胞種類繁多,但其共同特征是,具有典型的樹突狀形態(tài)、膜表面高表達(dá)MHC2類分子及C D80+、C D86+等共刺激分子、活化C D4+及C D8+T淋巴細(xì)胞、刺激雛型T淋巴細(xì)胞增殖活化、誘導(dǎo)特產(chǎn)生異樣CT L及免疫應(yīng)答。在外周血中含量約為白細(xì)胞總數(shù)的1%,分為髓系DC和淋巴系DC

3、兩大類,主要來(lái)自髓系。非成熟DC參與抗原的攝取、加工和處理,而成熟的DC則參與抗原的遞呈及活化T細(xì)胞,提呈抗原能力是巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞的1001000倍,是體內(nèi)唯一的職業(yè)抗原提呈細(xì)胞。來(lái)自血液的雛形淋巴細(xì)胞經(jīng)過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞微靜脈進(jìn)入淋巴組織,DC、濾泡型DC、B細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞共同聚集在濾泡區(qū)的生發(fā)中心參與抗體形成。之后經(jīng)輸出淋巴管進(jìn)入T細(xì)胞聚集區(qū),最后死亡。類漿細(xì)胞亞群DC從血液直接進(jìn)入T細(xì)胞區(qū),其生命周期仍不清楚(圖14。DC疫苗有一些特化作用,抗原捕獲、MHC復(fù)合體的形成及T細(xì)胞刺激作用。DC表達(dá)多種受體,其天然配體仍未探知,因此,抗受體的抗體常用作替代作者簡(jiǎn)介:潘春華(1968年-,女,博士

4、研究生,主治醫(yī)師,從事腫瘤生物治療及基因治療的研究;指導(dǎo)教師:羅榮城(1958年-,男,碩士,博士生導(dǎo)師,主任醫(yī)師,從事腫瘤生物治療及基因治療的研究。抗原。幾種受體是型跨膜蛋白,具有單一的外部C型植物凝血素區(qū)。FcR介導(dǎo)提呈MHC2類抗原的外源途徑。DC還表達(dá)高水平的選擇性T LRs,從而當(dāng)受微生物刺激后成熟。在成熟的過(guò)程中,DC產(chǎn)生并表達(dá)高水平的共刺激分子以促進(jìn)T細(xì)胞增殖分化(圖24。透射電鏡下可見(jiàn)DC伸展的突起,胞漿中富含線粒體,溶酶體較少。在掃描電鏡下可見(jiàn)胞體突起形成不規(guī)則形態(tài),細(xì)胞表面微絨毛消失,表面粗糙,層疊狀雛襞明顯。樹突狀突起粗、長(zhǎng),易觀察(圖3。2DC的來(lái)源及體外培養(yǎng)由于自體免

5、疫細(xì)胞與異體樹突狀細(xì)胞之間由于存在著人類白細(xì)胞抗原(H LA,如果基因型不相合會(huì)引起強(qiáng)烈的排斥反應(yīng),且受體內(nèi)的T細(xì)胞不能識(shí)別供者樹突狀細(xì)胞上非匹配的H LA分子,無(wú)法誘導(dǎo)有效的CT L的增殖及抗腫瘤作用,因而必須是自體的樹突狀細(xì)胞才能作為腫瘤疫苗的負(fù)載體用于臨床抗腫瘤治療。目前用作瘤苗的樹突狀細(xì)胞來(lái)源有:骨髓、外周血和新生兒臍帶血。3DC疫苗的種類目前,DC介導(dǎo)的疫苗主要有三大類:腫瘤抗原肽修飾的DC;細(xì)胞性腫瘤抗原修飾的DC;腫瘤抗原及細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染的DC,具體研究及應(yīng)用將在各具體疾病中詳細(xì)討論,現(xiàn)僅概述如下 。圖1樹突細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的循環(huán)Fig.1DC circulations and

6、lymphocyte 圖2樹突細(xì)胞捕獲抗原、形成MH C 多胎復(fù)合物和刺激T 細(xì)胞的特化作用Fig.2Some specializations of DCs for vaccine capture ,MH C 2peptide complex form ation ,and T cellstimulation 圖3掃描電鏡下觀察到的DC 細(xì)胞的形態(tài)(×5000Fig.3Morphology of DC observed by electron microscopy(×5000311腫瘤抗原肽修飾的DC 動(dòng)物模型及人體臨床試驗(yàn)已證明,腫瘤抗原肽(包括合成肽或腫瘤細(xì)胞相關(guān)抗原與

7、自身或同種異體的DC 共育,DC 與腫瘤表位肽結(jié)合之后可激發(fā)抗腫瘤CT L 有效的抗腫瘤免疫,將DC 回輸給機(jī)體,可預(yù)防腫瘤播散、復(fù)發(fā)及治療腫瘤?？捎米髁雒绲目乖挠心[瘤抗原、分化抗原、腫瘤獨(dú)特型抗體、癌基因及抑癌基因產(chǎn)物、粘蛋白等。用負(fù)載腫瘤表位肽的DC 免疫小鼠,可使具有同表位肽的腫瘤消退及抵抗致死劑量腫瘤細(xì)胞的攻擊。與此同時(shí),該類腫瘤的其它表位肽亦受攻擊,這種現(xiàn)象稱為表位擴(kuò)展(epitope spreading 。德國(guó)學(xué)者用負(fù)載Her2neu75肽或M UC1M1肽的DC 疫苗治療乳腺癌和卵巢癌5,在10例中有5例體內(nèi)檢測(cè)到了肽特異性CT L ,且持續(xù)6個(gè)月以上,1例病人經(jīng)幾次M UC1

8、肽DC 疫苗免疫后,檢測(cè)到了CE A 和M AGE 3肽特性T 細(xì)胞反應(yīng),另1例病人用Her2neu75肽DC 疫苗治療7次后,檢測(cè)到了M UC1肽特異性T 細(xì)胞反應(yīng),預(yù)示用單一抗原成功免疫后在體內(nèi)也可出現(xiàn)抗原的擴(kuò)展,這一結(jié)果對(duì)今后應(yīng)用其它肽DC 疫苗治療腫瘤有一定的指導(dǎo)作用。另外,應(yīng)用腫瘤抗原MHC 2類多肽沖擊樹突狀細(xì)胞,可提高腫瘤抗原濃度及其靶向性。利用弱酸洗脫法可獲得腫瘤細(xì)胞表面的MHC 2類抗原肽,試用于臨床也收到較好療效6。朱學(xué)軍等用該法提取的腫瘤抗原肽致敏DC 治療荷瘤小鼠也取得了較好的療效7。由于弱酸可以洗脫絕大部分腫瘤細(xì)胞表面與MHC 2類分子結(jié)合的多肽,對(duì)于那些MHC 2類

9、分子表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤,提供了一個(gè)較好的腫瘤抗原肽的來(lái)源,有希望用于臨床。G abrilovich 等用突變的P53多肽致敏DC 而制備的DC 疫苗可延長(zhǎng)攜帶人突變P53基因的荷瘤小鼠的生存時(shí)間8。腫瘤抗原肽致敏的DC 疫苗雖有上述優(yōu)點(diǎn),但也存在如下不足之處:難以確定最佳刺激劑量、抗原成分復(fù)雜、含有自身正?？乖⒁渍T發(fā)自身免性疾病等危險(xiǎn)。312細(xì)胞性腫瘤抗原修飾的DC 由于目前腫瘤特異性抗原或相關(guān)性抗原得到明確鑒定的為數(shù)甚少,因而予以瘤細(xì)胞全部抗原信息(如腫瘤細(xì)胞裂解物、腫瘤細(xì)胞提取物、腫瘤細(xì)胞的總RNA 或經(jīng)過(guò)滅活的完整的腫瘤細(xì)胞修飾DC 成為必要?；诩?xì)胞性腫瘤抗原易于獲取和制備,因而應(yīng)用全細(xì)

10、胞性腫瘤抗原沖擊致敏DC 的方法來(lái)制備DC 疫苗不失為一種簡(jiǎn)便而有實(shí)效的方法,有較大的臨床應(yīng)用潛力。近年來(lái),有人用腫瘤細(xì)胞與DC 融合的方法制備DC 疫苗。范國(guó)昌等用人樹突狀細(xì)胞與人白血病細(xì)胞K 562融合誘導(dǎo)出P210蛋白特異性的CT 9。由此提示,腫瘤細(xì)胞與DC 融合是制備DC 疫苗的又一方法。不足之處:所需要的瘤細(xì)胞數(shù)量多;非相關(guān)抗原量大且種類多,易誘發(fā)自身免疫病;所用的抗原多肽不一定能誘導(dǎo)最佳的抗腫瘤免疫反應(yīng),如因抗原調(diào)變、抗原脫失或抗原的低免疫原性等原因;刺激劑量難以確定。313腫瘤抗原基因轉(zhuǎn)染的DC疫苗基于DC的基因疫苗有:轉(zhuǎn)染腫瘤抗原的RNA的DC疫苗、轉(zhuǎn)染腫瘤抗原DNA的DC疫

11、苗以及轉(zhuǎn)染細(xì)胞因子基因的DC疫苗等。由于大部分腫瘤患者的瘤細(xì)胞的抗原的基因信息以及編碼的抗原不明確,或缺乏足夠的瘤組織而無(wú)法用抗原肽負(fù)載DC的方法制備DC瘤苗,而使患者失去治療機(jī)會(huì)10。分子生物學(xué)的發(fā)展使核酸擴(kuò)增成為可能,腫瘤抗原RNA或相應(yīng)的cD2 NA文庫(kù)為腫瘤抗原的來(lái)源提供了方法。通過(guò)核酸擴(kuò)增、差異篩選等方法獲得足夠的腫瘤細(xì)胞特異性mRNA,從而解決疫苗制備時(shí)腫瘤細(xì)胞來(lái)源困難及其特異性問(wèn)題,避免誘發(fā)自身免疫性疾病的危險(xiǎn)。同時(shí)經(jīng)基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞可持續(xù)表達(dá)腫瘤抗原,避免了前兩種疫苗因抗原解離或降解而影響其功能的不足。Nair等發(fā)現(xiàn)用編碼CE A抗原的RNA轉(zhuǎn)染的人DC在體外能誘發(fā)強(qiáng)而有力的

12、CT L反應(yīng)11。但是目前這種技術(shù)尚不很成熟。盡管基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果令人鼓舞,但基于花費(fèi)高及缺乏方便性,其商業(yè)可行性值得考慮,安全性更是不容忽視的問(wèn)題。因而針對(duì)上述要求,脂質(zhì)體聯(lián)合組織特異性基因表達(dá)系統(tǒng)似乎可以滿足條件12。曹雪濤等還將重組腺病毒介導(dǎo)的G M2CSF基因轉(zhuǎn)染樹突狀細(xì)胞,并經(jīng)腫瘤抗原沖擊致敏后與腫瘤細(xì)胞融合,制備出免疫原性更強(qiáng)的新型瘤苗以及用淋巴細(xì)胞趨化因子基因修飾的樹突狀細(xì)胞均誘導(dǎo)出特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答13。Nikitina等認(rèn)為約50%的人類惡性腫瘤存在基因突變或野生型P53,其過(guò)表達(dá)產(chǎn)生腫瘤表位14。用腺病毒介導(dǎo)野生型P53基因轉(zhuǎn)染DC,并用該DC 刺激T淋巴細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞來(lái)

13、自9例H LA2A2+的癌癥患者,3例H LA2A2+的健康人,觀察到該DC 對(duì)P53過(guò)表達(dá)的H LA2A2+的瘤細(xì)胞有強(qiáng)的細(xì)胞毒作用,而對(duì)P53非表達(dá)的瘤細(xì)胞及H LA2A2陰性瘤細(xì)胞卻無(wú)細(xì)胞毒作用,該作用具有特異性并由C D8+CT Ls介導(dǎo),說(shuō)明野生型P53轉(zhuǎn)染DC可誘導(dǎo)特異性的抗腫瘤免疫。Ishida等也研究了用腺病毒介導(dǎo)野生型P53基因轉(zhuǎn)染DC,發(fā)現(xiàn)DC感染腺病毒48小時(shí)后轉(zhuǎn)染率可達(dá)50%,轉(zhuǎn)染后的DC可有效誘導(dǎo)活化特異性的CT L,用其免疫表達(dá)人突變型P53基因的小鼠,85%可產(chǎn)生完全性免疫保護(hù)15。Ranieri等用重組腺病毒載體AdEG FP(可編碼一種強(qiáng)化的綠色熒光蛋白EG

14、FP轉(zhuǎn)染DC,使其表達(dá)E B病毒抗原(如潛在膜蛋白2B,LMP2B,并與E B 病毒血清學(xué)陽(yáng)性的健康供者的H LA2A2+的CT L共育,95%的DC于48小時(shí)后可檢測(cè)到綠色熒光蛋白(EG FP的表達(dá),Ad LMP2轉(zhuǎn)染的DC用來(lái)激活C D8+ T細(xì)胞,觀察針對(duì)LMP23292337肽的T淋巴細(xì)胞反應(yīng),第14天與第0天相比,從01003上升至013 (P<01001,第21天后可以觀察到針對(duì)自體E B病毒2B淋巴細(xì)胞瘤系細(xì)胞的特異性細(xì)胞溶解反應(yīng)16,提示E B病毒抗原基因轉(zhuǎn)染DC可用于E B病毒相關(guān)腫瘤的免疫治療,如鼻咽癌。另外,為其它與病毒感染有關(guān)的腫瘤的免疫治療提供借鑒。如上所述,D

15、C疫苗在腫瘤免疫治療中具有諸多優(yōu)勢(shì),但還有許多亟待解決的問(wèn)題:DC體外培養(yǎng)條件的規(guī)范化,如:細(xì)胞因子的種類、配伍及最佳的劑量組合等,因有些細(xì)胞因子的作用復(fù)雜,尚需明確;器皿的選擇;培養(yǎng)基的成分須進(jìn)一步明確與統(tǒng)一,做到有效、合理、經(jīng)濟(jì)的搭配。目前,各實(shí)驗(yàn)室所用培養(yǎng)基各異,如RPMI1640、I M DM等等,以使DC 活性得以最好的發(fā)揮;培養(yǎng)時(shí)血清的使用問(wèn)題,如用何種血清,人血清、小牛血清、胎牛血清,還是不用血清,血清中抗體是否影響DC抗原位點(diǎn)及其活性的發(fā)揮;可被DC有效提呈的腫瘤抗原及其RNA、DNA的認(rèn)識(shí)及獲取,運(yùn)用確實(shí)能夠誘導(dǎo)出具有殺傷活性的CT L的抗原或基因來(lái)刺激或轉(zhuǎn)導(dǎo)DC;成熟程度的

16、控制,由于非成熟DC的抗原攝取能力強(qiáng),而成熟DC的抗原提呈能力強(qiáng),前者誘發(fā)免疫耐受,后者誘發(fā)免疫應(yīng)答,DC的成熟發(fā)程度被看作是DC疫苗發(fā)揮功效的平臺(tái)4;制備DC基因疫苗所用的載體問(wèn)題,即:轉(zhuǎn)運(yùn)的高效性、對(duì)DC活性的影響、對(duì)機(jī)體無(wú)或盡可能少的毒副作用等,目前,DC疫苗所用的載體有:脂質(zhì)體、腺病毒、腺相關(guān)病毒、痘苗病毒等。相信,經(jīng)過(guò)不斷的探索與實(shí)踐,DC疫苗會(huì)在腫瘤免疫治療領(lǐng)域發(fā)揮出應(yīng)有的作用。4參考文獻(xiàn)1Berz ofsky J A,Jeffrey D.S trategies for designing and optimizing new gen2 eration vaccinesJ.Natu

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