淺論急性放射性分泌性中耳炎新西蘭兔模型的建立及研究

1、淺論急性放射性分泌性中耳炎新西蘭兔模型的建立及研究                作者：張志鋼 陳洽鑫 毛永林 鄭億慶 劉翔【摘要】  【目的】 建立急性放射性分泌性中耳炎的新西蘭兔動物模型，并觀察不同輻射劑量、方式對中耳的影響。 【方法】 72只健康的新西蘭兔隨機分成4組(每組18只)，包括對照組(A組)和3個實驗組B、C、D。 B組施加輻射劑量為30 Gy/次 × 1次，C組為10 Gy/次 × 3次，D組為10

2、 Gy/次 × 6次。在照射前及照射后第1天，第1、2、4、8、12周分別行耳內(nèi)鏡、中耳CT、聲阻抗檢查，并在放療后的每個觀察時間點處死各個組的3只兔子，取其鼻咽黏膜、聽泡行組織學(xué)檢查。【結(jié)果】 初步建立了急性放射性分泌性中耳炎的新西蘭兔動物模型?！窘Y(jié)論】 利用新西蘭兔建立放射性分泌性中耳炎的動物模型是可行的，但單次大劑量的電離輻射是成功建模的關(guān)鍵。 【關(guān)鍵詞】  輻射; 分泌性中耳炎; 動物模型Abstract： 【Objective】 To establish a model of radiological secretory otitis media using Ne

3、w Zealand rabbits， and to observe the results of different radiation dosages and modalities. 【Methods】 Seventy-two healthy New Zealand rabbits were randomly divided into four groups (18 for each)， including one control group named group A， and three experimental groups named group B， C and D. Group

4、B was administered with a radiation dose of 30 Gy per for once， while group C with 10 Gy per for three times and group D with 10 Gy per for six times. Before given the radiation and on the 1st day， 1st week， 2nd week， 4th week， 8th week and 12th week after， endotoscopy was carried out respectively a

5、s well as CT， auditory impedance test. Meanwhile， 3 rabbits each group for each time were sacrificed and specimens of bullae and mucous membrane of nasopharynx were collected for histological examination. 【Results】 Preliminary success was gained in the establishment of a animal model of secretory ot

6、itis media using New Zealand rabbits. 【Conclusions】 Using New Zealand rabbits for establishing a model of radiological secretory otitis media is viable， and a large radiation dose for a single time is the key point.放射治療是鼻咽癌的首選治療方法，放療后常有腮腺、腦干、視神經(jīng)等器官組織的放射性并發(fā)癥見報道，而中耳功能上的改變較少受到關(guān)注1。事實上，輻射引起分泌性中耳炎(secreto

7、ry otitis media， SOM)是非常常見的，可嚴(yán)重降低患者的生存質(zhì)量，且持續(xù)時間長，治療困難。為了深入研究其發(fā)病機制及探討有效的防治方法，建立一個好的放射性分泌性中耳炎的動物模型是有必要的。目前的相關(guān)報道都局限于鼠類模型的研究中，本實驗嘗試采用新西蘭兔為實驗動物，因其具有一定的優(yōu)勢，如對電離輻射及麻藥的耐受力強，且更加接近人體結(jié)構(gòu)，可模擬鼻咽癌放射治療的方法建立一個合適的動物模型，并經(jīng)此探討不同輻射劑量、方式對中耳的影響，有助于理解急性放射性分泌性中耳炎的發(fā)病機制。1 材料和方法1.1 材 料選擇健康新西蘭大白兔(雌雄不限)(由廣東省動物實驗中心提供粵監(jiān)證字：2008D006) 7

8、2只，入選條件：體質(zhì)量2.3 (S = 0.2) kg;耳內(nèi)鏡檢查外耳道皮膚無紅腫，鼓膜完整，無鼓室積液征;鼓室導(dǎo)抗圖為A型曲線圖;中耳CT提示正常。隨機分為4組，A組為實驗對照組，其余3組為實驗組，即B、C、D組。參照文獻3-4照射次數(shù)，同時模擬鼻咽癌患者放射劑量，對各組施加輻射照射：A組未予照射;B組(30 Gy/次，1次);C組(10 Gy/次，3次);D組(10 Gy/次，6次)。將購自中山大學(xué)的德國產(chǎn)戊巴比妥鈉配置成30 mL/L濃度。德國西門子，sensation 64，層厚0.6 mm，CTD 32.32 G，電壓：120 kV，電流146 mA，Kernel：u75usharp

9、+。1.2 方 法用3%戊巴比妥鈉將新西蘭兔成功麻醉后，按文獻3-4照射方法，俯臥位照射，照射野10 cm × 15 cm，源皮距60 cm，劑量深度2.5 cm。照射中心位于雙中耳之間，表面加蓋一厚約1 cm的濕毛巾作為補償膜，實驗對照組也麻醉后予以假照射。在施加輻射前及輻射達(dá)到總劑量后的第1天及第1、2、4、8、12周均依次行聲阻抗、中耳CT和耳內(nèi)鏡檢查，觀察外耳道、鼓膜、鼓室內(nèi)的改變。同時在每個觀察時間點上隨機處死各組中的3只兔子，取鼻咽部黏膜組織(部位：咽鼓管咽口的上方2 3 mm處)，再解剖游離出聽泡，將取出組織浸泡在配置好的40 g/L多聚甲醛溶液中固定36 h(聽泡必須

10、預(yù)先鉆孔注入多聚甲醛溶液)后，將后者在50 mL/L硝酸溶液中脫鈣24 h，取出在聽泡后經(jīng)鼓岬垂直切開，酒精脫酸、脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色觀察鼻咽部、聽泡內(nèi)的組織變化。2 結(jié) 果2.1 中耳CT檢查結(jié)果施加輻射照射后各時間點分別做中耳CT檢查，可見A、C、D組均未出現(xiàn)異常表現(xiàn)(圖1a、c);而B組則在第8周時有3只兔子單側(cè)鼓室內(nèi)出現(xiàn)積液征(圖1b)。2.2 耳內(nèi)鏡檢查結(jié)果施加輻射照射前健康兔外耳道無充血、腫脹，鼓膜形態(tài)正常，無充血或光錐改變(圖2a)。B組照射后第8周時出現(xiàn)中耳積液，耳內(nèi)鏡下見外耳道皮膚充血、腫脹，鼓膜增厚，光錐縮短、分散(圖2b)，與其CT結(jié)果一致。C組照射后8周時無

11、中耳炎跡象(圖2c)。D組照射后8周時外耳道及鼓膜明顯腫脹(圖2d)。2.3 聲阻抗檢查結(jié)果鼓室導(dǎo)抗圖測試圖型按Liden/Jerger分類法，正常兔子麻醉狀態(tài)下均為A型圖或As型圖，本文統(tǒng)稱有峰型圖。施加輻射照射前的導(dǎo)納值、峰壓值、耳道容積及梯度值范圍分別為0.2 1.0 mL、-500 +950 Pa、1.89 2.55 mL和0 0.58。其中峰壓值范圍在-500 +500 Pa之間的占91.6%，平均水平為(-90 ± 150) Pa，具體分布見表1。施加輻射照射后，鼓室導(dǎo)抗圖測試144耳中有45耳為C型鼓室曲線，其中最大的負(fù)壓為-1 200 Pa，3耳為B型圖，41耳為A型

12、圖，6耳因外耳道炎不能測鼓室導(dǎo)抗圖?？傮w觀察造模后的聲納值變大，峰壓值均向負(fù)值方向變化，梯度值變化不大。         2.4 HE染色組織學(xué)檢查結(jié)果A組(對照組)：鼻咽部黏膜被覆假復(fù)層纖毛柱狀上皮，內(nèi)有杯狀細(xì)胞，固有層中混有混合腺體，腺體無增生(圖3a)。鼓岬黏膜扁平上皮完整，黏膜下組織無水腫，無血管無張、纖維增生(圖4a)。B組：切片中見鼻咽部假復(fù)層纖毛柱狀上皮凌亂、脫落，杯狀細(xì)胞增多(圖3b)。鼓岬黏膜上皮完整，黏膜下組織水腫，毛細(xì)血管明顯擴張，纖維組織增生(圖4b)。C組：鼻咽部被覆假復(fù)層纖毛柱狀上皮，杯

13、狀細(xì)胞和腺體無增生(圖3c)。鼓岬黏膜上皮完整，黏膜下血管無擴張，無明顯纖維增生及水腫(圖4c)。D組：鼻咽部假復(fù)層纖毛柱狀上皮尚完整，杯狀細(xì)胞和腺體增生(圖3d)。鼓岬黏膜上皮為扁平上皮，黏膜下血管稍擴張，纖維增生和水腫不明顯(圖4d)。3 討 論3.1 急性放射性分泌性中耳炎兔動物模型的建立目前已知的動物模型：放射性分泌性中耳炎的豚鼠模型國外僅有Ohashih等和國內(nèi)劉建平等都利用豚鼠制造中耳黏膜的輻射研究模型;多數(shù)分泌性中耳炎動物模型是經(jīng)鼓膜給變應(yīng)原建立的;Russell和Giles則采用堵塞咽鼓管中段及向骨部走行處的方法建立了小鼠的分泌性中耳炎模型，可長期保持無菌的分泌性中耳炎。總的來

14、說，目前的相關(guān)報道多局限于鼠類的研究中。本實驗則嘗試了另一種動物模型新西蘭兔，初步建立了放射性分泌性中耳炎的動物模型。在使用單次30 Gy大劑量的輻射照射后第8周時出現(xiàn)了SOM，而分次小劑量(10 Gy/次，總劑量為30 Gy和60 Gy的2個組)的照射卻不會造成放射后早期中耳黏膜的明顯改變和鼓室積液，可見單次大劑量電離輻射是成功建模的關(guān)鍵。合適實驗動物的選擇對于模型的成功建立也有重要的意義。選擇新西蘭兔作為動物模型有一定的優(yōu)勢：對電離輻射的耐受力強。文獻報道豚鼠電離輻射實驗死亡率達(dá)14.5%(35只豚鼠死亡5只)，且既往實驗研究分次照射動物死亡率高，而本實驗中兔子無論采用一次大劑量照射還是分

15、次照射，均無1例死亡。對麻藥的耐受力很強。邢冶剛等認(rèn)為保證動物生存的麻醉次數(shù)最多不宜超過6次，本實驗為保證新西蘭兔照射野的固定并配合耳內(nèi)鏡等檢查，幾乎每個項目都采用靜脈麻醉，麻醉次數(shù)最多的可達(dá)15次，但并未有因麻醉致死，這說明選用兔子建模更有優(yōu)勢，也間接說明3%戊巴比妥鈉是相對安全的。兔子中耳聽泡大，解剖結(jié)構(gòu)與人類更接近，模擬效果更好?？梢娎眯挛魈m兔建立放射性分泌性中耳炎的動物模型是可行的。當(dāng)然選用兔子作為研究對象也有局限性：兔子外耳道深，一旦發(fā)生了外耳道炎則難以痊愈，易并發(fā)化膿性中耳炎。外耳道感覺敏感，為配合外耳道操作，本實驗采用靜脈麻醉使兔子達(dá)到一定的麻藥深度，并加用丁卡因表面麻醉外耳道

16、，要注意動作輕柔，忌損傷外耳道影響視野。本實驗也注意到兔子傾斜的鼓膜大部分被外耳道深部兩側(cè)的骨性突起遮蓋(圖2A)，對于要求觀察鼓膜全貌變化的實驗是有一定受限的。【參考文獻】  Wang SZ， Li J， Miyamoto CT， et al. A study of middle ear function in the treatment of nasopharyngeal carcinoma with IMRT technique J. Radiother Oncol， 2009， 93(3)： 530-533.Ohashi Y， Nakai y， Esaki Y， et al.

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